이 프로토콜은 내피 트랜스사이토시스에 특별히 초점을 맞춘 혈액-망막 또는 혈액-뇌 장벽과 같은 선택적 혈관 장벽의 기능 및 투과성을 연구하는 데 유용한 세포 기반 모델을 제공합니다. 이 분석은 살아있는 동물이 필요 없이 설정 및 사용이 쉽습니다. 내피 세포 투과성 및 내부 혈액 망막 장벽 무결성에 영향을 미치는 전이 세포증의 다양한 분자 조절자를 조사하는 데 활용할 수 있습니다.
이 분석은 혈관 생물학과 눈 및 뇌 연구에 대한 통찰력을 제공하여 BRB BBB 제어의 기초가되는 분자 메커니즘을 더 잘 이해하고 장벽을 넘어 잠재적 인 약물 전달을 탐색 할 수 있습니다. 시작하려면 층류 후드 아래에서 30분 동안 각 삽입물을 200마이크로리터의 0.1% 젤라틴 용액으로 코팅하여 인간 망막 미세혈관 내피 세포 또는 HRMEC를 파종하기 위한 세포 배양 필터 삽입물을 준비합니다. 용액이 필터 인서트의 전체 바닥 표면을 덮는지 확인하십시오.
배양 된 HRMEC가 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 배양 된 페트리 접시를 가져 와서 성장 배지를 흡인합니다. 층류 후드 아래에 10 밀리리터의 1X PBS로 세포를 두 번 부드럽게 헹구어 잠재적 인 부유 세포 또는 죽은 세포를 제거하십시오. 세포를 0.5-1 밀리리터의 0.25 % 트립신 -EDTA 용액으로 해리시키고 페트리 접시를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소의 인큐베이터에 5 분 동안 놓습니다.
4.5 내지 9 밀리리터의 성장 배지를 첨가하여 트립신 활성을 퀀칭하고 10 밀리리터 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮긴다. 실온에서 5 분 동안 세포를 200 회 g으로 회전시킨다. 상청액을 조심스럽게 제거하고 3ml의 성장 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
수동 혈구계 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 세포 수를 계산하고 필터 삽입 당 40, 000 세포의 밀도로 시드합니다. 각 삽입물에 대한 세포 현탁액의 부피는 250 마이크로리터입니다. 투과성 삽입물이 들어 있는 웰에서 코팅 용액을 흡입하고 삽입물당 250마이크로리터의 세포 현탁액을 옮긴 다음 삽입물 중 하나에 매체만 추가하면 경내피 전기 저항 또는 TEER 측정을 위한 블랭크 컨트롤로 사용됩니다.
동시에, 기저 측 챔버에 우물 당 750 마이크로 리터의 배지를 추가하십시오. 배양된 세포가 완전히 합류하고 평방 센티미터당 약 20옴의 원하는 TEER 값이 달성될 때까지 7-12일 동안 배양기에 투과성 삽입물이 있는 24웰 플레이트를 섭씨 37도 및 5%이산화탄소로 보관하십시오. TEER 측정 전에, 온도 평형화를 위해 실온에서 15 내지 20분 동안 층류 후드에 셀 함유 24웰 플레이트를 배치한다.
HRMEC에 대한 TEER을 측정하려면 상피 볼트/옴 미터 전기 저항 시스템을 사용하여 전극을 미터에 연결하고 먼저 70% 에탄올에 15-20분 동안 담근 다음 세포 배양 EGM 성장 배지에 잠시 담가 전극을 평형화합니다. 짧은 팁이 인서트에 있고 긴 팁이 웰 바닥에 닿도록 전극을 조심스럽게 담그고 TEER 측정을 수행합니다. 먼저 블랭크 컨트롤의 저항을 측정한 다음 각 인서트에 대해 TEER을 3배로 측정합니다.
약 20옴 제곱센티미터의 TEER 값과 합류점에 도달하면 리간드로 처리하기 전에 두 챔버에서 EBM에서 0.5%FBS를 사용하여 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 24시간 동안 세포를 혈청 박탈합니다. 혈청-감소된 EBM을 분석 전반에 걸쳐 사용하였다. 세포를 형광 시아닌-3-태그와 함께 정점 챔버에서 혈청 환원 배지를 사용하여 섭씨 37도에서 60분 동안 트랜스페린 리간드로 인큐베이션한다.
단분자층을 혈청 감소 배지로 정점 및 기저측으로 4회 세척한 후, 세포를 포함하는 필터 삽입물에 새로운 배지를 추가하고 삽입물을 예열된 혈청 감소 배지를 포함하는 24웰 플레이트의 신선한 웰로 옮깁니다. 인큐베이터에서 세포를 90 분 더 배양 한 다음 기저 측 챔버에서 배지를 수집합니다. 형광 검출기를 사용하여 기저측 챔버로부터의 용액의 형광 강도를 기록한다.
약 20옴 제곱센티미터의 TEER 값으로 합류하면 리간드로 처리하기 전에 두 챔버 모두에서 EBM에서 0.5% FBS를 사용하여 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 24시간 동안 세포를 혈청 박탈합니다. 혈청-감소된 EBM을 분석 전반에 걸쳐 사용하였다. 다음으로, 정점 챔버의 세포를 원하는 치료 및 비히클 제어로 처리하십시오.
양 고추 냉이 과산화 효소 (HRP) 밀리리터 당 5 밀리그램을 세포에 추가하고 섭씨 37도에서 15 분 동안 배양합니다. 새로운 혈청 환원 배지를 정점 챔버에 추가하고 삽입물을 예열 된 배지가 들어있는 신선한 우물로 옮깁니다. 인큐베이터에서 추가로 90 분 동안 단층을 배양하십시오.
기저측 챔버로부터 배지를 수집 한 후, 수집 된 배지에 100 마이크로 리터의 HRP 플루오로 제닉 퍼 옥시 다제 기질을 첨가하고 실온에서 10 분 동안 배양한다. 100 마이크로리터의 정지 용액으로 반응을 중지하고 형광 플레이트 판독기를 사용하여 배지에서 HRP 기질 반응 생성물의 수준을 검출합니다. 시험관 내 트랜스사이토시스 분석을 시연하기 전에, 망막에서 내피 세포 트랜스사이토시스의 시각화가 배경 정보로 표시됩니다.
여기서, 광학 현미경 이미지는 DAB로 염색된 3개월 된 야생형 마우스 망막 절편으로부터의 HRP 충진 혈관 내강을 나타낸다. HRP는 역궤도 주입되었다. HRP로 채워진 망막 혈관은 광학 현미경으로 짙은 갈색 침전물로 볼 수 있습니다.
투과 전자 현미경 초박형 섹션은 내부 혈액 망막 장벽을 가로 지르는 EC 트랜스 사이토 시스를 묘사하는 RMEC가있는 HRP로 채워진 트랜스 사이토 틱 혈관을 보여줍니다. 여기서 큰 소포는 잠재적으로 루미놀 쪽의 마크로피노솜과 적혈구를 반사합니다. TeM 이미지는 RMEC 내에서 HRP로 채워진 작은 트랜스사이토시스 소포, 아마도 카베올라 소포를 보여줍니다.
CAV-1 항체와 이소렉틴 B4의 면역조직화학 염색은 3개월 된 야생형 마우스 망막에서 망막 혈관의 카베올라 소포 마커인 CAV-1의 국소화를 보여줍니다. 망막 내피 세포 내 면역금 표지된 CAV-1의 TeM 이미지는 CAV-1 양성 카베올라 소포의 확대 이미지와 함께 여기에 도시되어 있다. 트랜스페린을 사용하는 HRMEC에서 클라 트린 매개 EC 트랜스 사이토 시스 분석의 경우, 형광 현미경 이미지는 파란색의 DAPI로 염색 된 HRMEC 내에서 붉은 색으로 세포 내 이입 된 Cy3 트랜스페린을 보여줍니다.
HRP를 사용하는 카베올라 매개 EC 트랜스사이토시스의 경우, 여기에서 Wnt 신호전달이 분석을 입증하기 위한 예로서 사용된다. Wnt 신호 전달은 최근 카베올라 매개 EC 트랜스사이토시스를 조절하는 것으로 밝혀졌습니다. 세포를 Wnt 경로 활성화제 Wnt3a-조절 배지 및 Wnt 신호전달 억제제 XAV939 및 이들의 반응성 대조군의 유무에 관계없이 재조합 노린으로 처리하였다.
Wnt 활성화 제는 XAV939에 의해 역전 된 HRP 기반 트랜스 사이토 시스의 수준을 감소 시켰습니다. 올바른 TEER 측정은 단층 무결성을 결정하는 데 중요합니다. 부적절한 취급, 온도 변동, 배양 배지, 배양 기간 등과 같은 다양한 요인의 영향을 크게 받습니다.
이 분석은 생체 내 조건을 모방한 공동 배양 또는 3D 유기형 배양 시스템으로 변형될 수 있습니다.
