Dieses Protokoll bietet ein nützliches zellbasiertes Modell zur Untersuchung der Funktion und Permeabilität selektiver Gefäßbarrieren wie der Blutretina- oder Blut-Hirn-Schranke mit besonderem Fokus auf endotheliale Transzytose. Dieser Assay ist einfach einzurichten und zu verwenden und erfordert keine lebenden Tiere. Es kann zur Untersuchung verschiedener molekularer Regulatoren der Endothelzellpermeabilität und Transzytose verwendet werden, die die innere Integrität der Blut-Netzhaut-Barriere beeinflussen.
Dieser Assay kann Einblicke in die vaskuläre Biologie sowie in die Augen- und Hirnforschung geben, was ein besseres Verständnis der Molekülmechanismen ermöglicht, die der BRB-BBB-Kontrolle zugrunde liegen, und die Erforschung einer potenziellen Medikamentenabgabe über die Barrieren hinweg. Bereiten Sie zunächst die Zellkulturfiltereinsätze für die Aussaat menschlicher retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen oder HRMECs vor, indem Sie jeden Einsatz 30 Minuten lang unter einer Laminar-Flow-Haube mit 200 Mikrolitern 0,1% Gelatinelösung beschichten. Stellen Sie sicher, dass die Lösung die gesamte Unterseite des Filtereinsatzes bedeckt.
Nehmen Sie eine Petrischale mit kultivierten HRMECs, die bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubiert wurden, und saugen Sie die Wachstumsmedien ab. Spülen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 10 Milliliter 1X PBS unter der Laminar-Flow-Haube, um die potenziellen schwimmenden oder toten Zellen loszuwerden. Dissoziieren Sie die Zellen mit 0,5 bis 1 Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung und legen Sie die Petrischale bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 5 Minuten in den Inkubator.
Löschen Sie die Trypsinaktivität durch Zugabe von 4,5 bis 9 Milliliter Wachstumsmedien und überführen Sie die Zellsuspension mit einer 10-Milliliter-Pipette in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Drehen Sie die Zellen bei 200 mal g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 3 Milliliter Wachstumsmedien.
Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem manuellen Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler und säen Sie mit einer Dichte von 40.000 Zellen pro Filtereinsatz. Das Volumen der Zellsuspension für jeden Einsatz beträgt 250 Mikroliter. Die Beschichtungslösung wird aus den Vertiefungen mit durchlässigen Einsätzen abgesaugt und 250 Mikroliter der Zellsuspension pro Einsatz überführt, dann nur Medium zu einem der Einsätze hinzugefügt, das als Blindkontrolle für die Messung des transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER) verwendet wird.
Gleichzeitig fügen Sie auch 750 Mikroliter Medium pro Vertiefung in den basolateralen Kammern hinzu. Halten Sie die 24-Well-Platte mit durchlässigen Einsätzen im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 7 bis 12 Tage, bis die kultivierten Zellen vollständig konfluent sind und der gewünschte TEER-Wert von etwa 20 Ohm pro Quadratzentimeter erreicht ist. Vor TEER-Messungen die zellhaltige 24-Well-Platte für 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur in die Laminar-Flow-Haube legen, um den Temperaturausgleich zu erreichen.
Um den TEER für HRMECs mit einem elektrischen Widerstandssystem für Epithelvolt / Ohm zu messen, verbinden Sie die Elektrode mit dem Messgerät und gleichen Sie die Elektrode aus, indem Sie sie zuerst 15 bis 20 Minuten lang in 70% Ethanol einweichen und dann kurz in das EGM-Wachstumsmedium der Zellkultur eintauchen. Führen Sie die TEER-Messung durch, indem Sie die Elektrode vorsichtig eintauchen, so dass sich die kürzere Spitze im Einsatz befindet und die längere Spitze den Boden der Vertiefung berührt. Messen Sie zuerst den Widerstand über den Blank-Regler und dann für jede Einlage TEER in dreifacher Ausfertigung.
Bei Erreichen des Zusammenflusses mit TEER-Werten um 20 Ohm Quadratzentimeter werden die Zellen vor der Behandlung mit dem Liganden 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit 0,5% FBS in EBM in beiden Kammern beraubt. Serumreduziertes EBM wurde während des gesamten Assays verwendet. Inkubieren Sie die Zellen mit dem serumreduzierten Medium in der apikalen Kammer mit fluoreszierendem Cyanin-3-Tag zum Transferrin-Liganden für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Nach dem 4-fachen Waschen der Monoschicht apikal und basolateral mit dem serumreduzierten Medium frisches Medium in die Filtereinsätze mit den Zellen geben und die Einsätze in frische Vertiefungen der 24-Well-Platte mit vorgewärmtem serumreduziertem Medium überführen. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 90 Minuten im Inkubator und sammeln Sie dann das Medium aus der basolateralen Kammer. Die Fluoreszenzintensität der Lösung aus der basolateralen Kammer wird mit einem Fluoreszenzdetektor aufgezeichnet.
Bei Erreichen des Zusammenflusses mit TEER-Werten um 20 Ohm Quadratzentimeter Serumentzug der Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid unter Verwendung von 0,5% FBS in EBM in beiden Kammern vor der Behandlung mit dem Liganden. Serumreduziertes EBM wurde während des gesamten Assays verwendet. Als nächstes behandeln Sie die Zellen in der apikalen Kammer mit den gewünschten Behandlungen und Vehikelkontrollen.
Fügen Sie 5 Milligramm pro Milliliter Meerrettichperoxidase oder HRP zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Geben Sie frisches, serumreduziertes Medium in die apikale Kammer und geben Sie die Einsätze in eine frische Vertiefung, die vorgewärmte Medien enthält. Inkubieren Sie die Monoschicht für weitere 90 Minuten im Inkubator.
Nach dem Sammeln von Medium aus der basolateralen Kammer 100 Mikroliter HRP-fluorogenes Peroxidasesubstrat in das gesammelte Medium geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion mit 100 Mikrolitern Stopplösung und detektieren Sie die Konzentrationen des HRP-Substratreaktionsprodukts in den Medien mit einem Fluoreszenzplattenleser. Vor der Demonstration der in vitro Transzytose-Assays wird die Visualisierung der Endothelzelltranszytose in der Netzhaut als Hintergrundinformation gezeigt.
Hier zeigt das lichtmikroskopische Bild ein HRP-gefülltes Blutgefäßlumen aus einem 3 Monate alten Wildtyp-Maus-Netzhautabschnitt, der mit DAB gefärbt ist. HRP wurde retroorbital injiziert. HRP-gefüllte Netzhautgefäße können unter dem Lichtmikroskop als dunkelbrauner Niederschlag gesehen werden.
Der ultradünne Transmissionselektronenmikroskop zeigt HRP-gefüllte transzytotische Gefäße mit RMECs, die die EC-Transzytose über die innere Blut-Netzhaut-Barriere darstellen. Hier reflektiert das große Vesikel möglicherweise Makropinosom und ein rotes Blutkörperchen auf der Luminolseite. Das TeM-Bild zeigt HRP-gefüllte kleine transzytotische Vesikel, wahrscheinlich Caveola-Vesikel, innerhalb des RMEC.
Die immunhistochemische Färbung von CAV-1-Antikörpern und Isolectin B4 zeigt die Lokalisation von CAV-1, einem Marker von Caveola-Vesikeln in retinalen Blutgefäßen, in der 3 Monate alten Wildtyp-Mausnetzhaut. TeM-Bild von Immunogold-markiertem CAV-1 innerhalb der retinalen Endothelzellen ist hier mit einem vergrößerten Bild von CAV-1-positivem Caveola-Vesikel gezeigt. Für Clathrin-vermittelte EC-Transzytose-Assays in HRMECs unter Verwendung von Transferrin zeigt hier ein fluoreszenzmikroskopisches Bild endozytosiertes Cy3-Transferrin in roter Farbe innerhalb von HRMECs, die mit DAPI in blau gefärbt sind.
Für die Caveolae-vermittelte EC-Transzytose mittels HRP wird der Wnt-Signalweg hier als Beispiel zur Demonstration des Assays verwendet. Kürzlich wurde festgestellt, dass der Wnt-Signalweg die Caveolae-vermittelte EC-Transzytose reguliert. Die Zellen wurden mit Wnt-Signalweg-Aktivator Wnt3a-konditioniertem mittlerem und rekombinantem Norrin mit oder ohne Wnt-Signalinhibitor XAV939 und ihren reaktiven Kontrollen behandelt.
Wnt-Aktivatoren reduzierten das Niveau der HRP-basierten Transzytose, die durch XAV939 umgekehrt wurden. Die korrekte TEER-Messung ist entscheidend für die Bestimmung der Monolayer-Integrität. Es wird stark von verschiedenen Faktoren wie unsachgemäßer Handhabung, Temperaturschwankungen, Kulturmedium, Kulturdauer usw. beeinflusst.
Dieser Assay könnte als Kokultur oder 3D-Organotypisches Kultursystem modifiziert werden, das In-vivo-Bedingungen nachahmt.
