Este protocolo fornece um modelo celular útil para estudar a função e a permeabilidade de barreiras vasculares seletivas, como a barreira hemato-retiniana ou hematoencefálica, com foco específico na transcitose endotelial. Este ensaio é fácil de configurar e usar, não exigindo animais vivos. Pode ser utilizado para investigar vários reguladores moleculares da permeabilidade das células endoteliais e da transcitose que afetam a integridade da barreira hemato-retiniana interna.
Este ensaio pode fornecer insights sobre biologia vascular e pesquisa ocular e cerebral, permitindo uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao controle do BRB BBB e explorando a potencial entrega de medicamentos através das barreiras. Para começar, prepare as inserções de filtro de cultura celular para semear células endoteliais microvasculares da retina humana ou HRMECs, revestindo cada inserção com 200 microlitros de solução de gelatina a 0,1% por 30 minutos sob um exaustor de fluxo laminar. Certifique-se de que a solução cobre toda a superfície inferior da inserção do filtro.
Pegue uma placa de Petri com HRMECs cultivados incubados a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e aspirar o meio de crescimento. Lave suavemente as células duas vezes com 10 mililitros de 1X PBS sob o exaustor de fluxo laminar para se livrar das potenciais células flutuantes ou mortas. Dissociar as células com 0,5 a 1 mililitro de solução de 0,25% tripsina-EDTA e colocar a placa de Petri na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 5 minutos.
Apague a atividade da tripsina adicionando 4,5 a 9 mililitros de meios de crescimento e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros usando uma pipeta de 10 mililitros. Gire as células a 200 vezes g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3 mililitros de meios de crescimento.
Conte o número de células usando um hemocitômetro manual ou um contador de células automatizado e sementes a uma densidade de 40.000 células por inserção de filtro. O volume de suspensão celular para cada pastilha é de 250 microlitros. Aspirar a solução de revestimento dos poços contendo inserções permeáveis e transferir 250 microlitros da suspensão celular por inserção, em seguida, adicione apenas o meio a uma das pastilhas, que será usado como um controle em branco para a medição da resistência elétrica transendotelial, ou TEER.
Simultaneamente, adicione também 750 microlitros de meio por poço nas câmaras basolaterais. Mantenha a placa de 24 poços com inserções permeáveis na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 7 a 12 dias até que as células cultivadas se tornem totalmente confluentes e o valor TEER desejado de cerca de 20 ohms por centímetro quadrado seja alcançado. Antes das medições TEER, coloque a placa de 24 poços contendo células no exaustor de fluxo laminar à temperatura ambiente por 15 a 20 minutos para equilíbrio da temperatura.
Para medir o TEER para HRMECs, usando um sistema epitelial de resistência elétrica do medidor de volts/ohm, conecte o eletrodo ao medidor e equilibre o eletrodo primeiro mergulhando-o em etanol a 70% por 15 a 20 minutos e, em seguida, imergindo-o brevemente no meio de crescimento EGM de cultura celular. Realize a medição TEER imergindo cuidadosamente o eletrodo, de modo que a ponta mais curta esteja na inserção e a ponta mais longa toque o fundo do poço. Meça a resistência através do controle em branco primeiro e, em seguida, para cada inserção, meça o TEER em triplicados.
Ao atingir a confluência com os valores de TEER em torno de 20 ohm centímetros quadrados, privar as células de soro por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono usando 0,5% de FBS em EBM em ambas as câmaras antes do tratamento com o ligante. A EBM com redução sérica foi utilizada durante todo o ensaio. Incubar as células usando o meio reduzido de soro na câmara apical com ligante fluorescente de cianina 3-tag para transferrina por 60 minutos a 37 graus Celsius.
Depois de lavar a monocamada apicamente e basolateralmente 4 vezes com o meio com soro reduzido, adicione o meio fresco às inserções de filtro contendo as células e transfira as inserções para poços frescos da placa de 24 poços contendo meio pré-aquecido com soro reduzido. Incubar as células por mais 90 minutos na incubadora e, em seguida, coletar o meio da câmara basolateral. Registar a intensidade de fluorescência da solução a partir da câmara basolateral utilizando um detector de fluorescência.
Ao atingir a confluência com os valores de TEER em torno de 20 ohm centímetros quadrados, privar as células de soro por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono usando 0,5% de FBS em EBM em ambas as câmaras antes do tratamento com o ligante. A EBM com redução sérica foi utilizada durante todo o ensaio. Em seguida, trate as células na câmara apical com os tratamentos desejados e controles do veículo.
Adicione 5 miligramas por mililitro de peroxidase de rábano, ou HRP, às células e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius. Adicione o meio fresco com soro reduzido à câmara apical e transfira as inserções para um poço fresco contendo meio pré-aquecido. Incubar a monocamada por mais 90 minutos na incubadora.
Após a coleta do meio da câmara basolateral, adicionar 100 microlitros de substrato de peroxidase fluorogênica HRP ao meio coletado e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos. Pare a reação com 100 microlitros de solução de parada e detecte os níveis do produto de reação do substrato HRP no meio usando um leitor de placa de fluorescência. Antes de demonstrar os ensaios de transcitose in vitro, a visualização da transcitose de células endoteliais na retina é mostrada como informação de base.
Aqui, a imagem do microscópio de luz mostra um lúmen de vaso sanguíneo cheio de HRP de uma seção de retina de camundongo do tipo selvagem de 3 meses de idade corada com DAB. A HRP foi injetada retroorbitalmente. Os vasos da retina cheios de HRP podem ser vistos como precipitado marrom escuro sob o microscópio de luz.
A seção ultrafina do microscópio eletrônico de transmissão mostra vasos transcitóticos cheios de HRP com RMECs representando transcitose CE através da barreira hemato-retiniana interna. Aqui, a grande vesícula reflete potencialmente o macropinossomo e um glóbulo vermelho no lado do luminol. A imagem TeM mostra pequenas vesículas transcitóticas cheias de HRP, provavelmente vesículas de caveola, dentro do RMEC.
A coloração imuno-histoquímica do anticorpo CAV-1 e da isolectina B4 demonstra a localização do CAV-1, um marcador de vesículas de caveola nos vasos sanguíneos da retina, na retina de camundongo do tipo selvagem de 3 meses de idade. A imagem TeM de CAV-1 marcada com imunoouro dentro das células endoteliais da retina é mostrada aqui com uma imagem ampliada da vesícula de caveola positiva para CAV-1. Para o ensaio de transcitose EC mediada por clatrina em HRMECs usando transferrina, aqui, uma imagem de microscópio de fluorescência mostra a transferrina Cy3 endocitosada na cor vermelha dentro de HRMECs corados com DAPI em azul.
Para transcitose EC mediada por cavéolas usando HRP, a sinalização Wnt aqui é usada como um exemplo para demonstrar o ensaio. Recentemente, descobriu-se que a sinalização Wnt regula a transcitose CE mediada por cavéolas. As células foram tratadas com o ativador da via Wnt Wnt3a-condicionado meio e Norrin recombinante, com ou sem inibidor de sinalização Wnt XAV939 e seus controles reativos.
Os ativadores Wnt reduziram o nível de transcitose baseada em HRP, que foram revertidos pelo XAV939. A medição correta do TEER é crucial para determinar a integridade da monocamada. É muito afetado por vários fatores, como manuseio inadequado, flutuações de temperatura, meio de cultura, duração da cultura, etc.
Este ensaio pode ser modificado como sistemas de co-cultura ou cultura organotípica 3D imitando condições in vivo.
