يوفر هذا البروتوكول نموذجا مفيدا قائما على الخلايا لدراسة وظيفة ونفاذية الحواجز الوعائية الانتقائية مثل الحاجز الدموي الشبكي أو الحاجز الدموي الدماغي مع التركيز بشكل خاص على ترانسكيتوسيس البطانة. هذا الفحص سهل الإعداد والاستخدام لا يتطلب حية. يمكن استخدامه للتحقيق في مختلف المنظمين الجزيئيين لنفاذية الخلايا البطانية و transcytosis التي تؤثر على سلامة الحاجز الدموي الداخلي للشبكية.
يمكن أن يوفر هذا الفحص نظرة ثاقبة على بيولوجيا الأوعية الدموية وأبحاث العين والدماغ ، مما يسمح بفهم أفضل لآليات الجزيئات الكامنة وراء التحكم في BRB BBB واستكشاف توصيل الدواء المحتمل عبر الحواجز. للبدء ، قم بإعداد إدخالات مرشح زراعة الخلايا لبذر الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في شبكية العين البشرية أو HRMECs ، عن طريق طلاء كل إدراج ب 200 ميكرولتر من محلول الجيلاتين 0.1٪ لمدة 30 دقيقة تحت غطاء التدفق الرقائقي. تأكد من أن المحلول يغطي السطح السفلي بالكامل لإدراج الفلتر.
خذ طبق بتري مع HRMECs المستزرعة المحتضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون ، واستنشق وسائط النمو. شطف الخلايا بلطف مرتين مع 10 ملليلتر من 1X PBS تحت غطاء التدفق الرقائقي للتخلص من الخلايا العائمة أو الميتة المحتملة. افصل الخلايا بمحلول 0.5 إلى 1 ملليلتر من محلول 0.25٪ من التربسين-EDTA وضع طبق بتري في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 5 دقائق.
قم بإخماد نشاط التربسين عن طريق إضافة 4.5 إلى 9 ملليلتر من وسائط النمو ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر باستخدام ماصة 10 ملليلتر. تدور الخلايا في 200 مرة غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة supernatant بعناية وأعد تعليق الكريات في 3 ملليلتر من وسائط النمو.
احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم اليدوي أو عداد الخلايا الآلي والبذور بكثافة 40،000 خلية لكل إدراج مرشح. حجم تعليق الخلية لكل إدراج هو 250 ميكرولتر. قم بشفط محلول الطلاء من الآبار التي تحتوي على إدخالات نفاذة ونقل 250 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل إدراج ، ثم أضف متوسطا فقط إلى أحد الإدخالات ، والذي سيتم استخدامه كعنصر تحكم فارغ للمقاومة الكهربائية عبر البطانية ، أو TEER ، القياس.
في الوقت نفسه ، أضف أيضا 750 ميكرولتر من الوسط لكل بئر في الغرف القاعدية. احتفظ بالصفيحة المكونة من 24 بئرا مع إدخالات نفاذة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 7 إلى 12 يوما حتى تصبح الخلايا المستزرعة ملتقية تماما ويتم تحقيق قيمة TEER المطلوبة البالغة حوالي 20 أوم لكل سنتيمتر مربع. قبل قياسات TER، ضع الصفيحة المحتوية على 24 بئرا تحتوي على خلية في غطاء التدفق الرقائقي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة لتحقيق توازن درجة الحرارة.
لقياس TEER ل HRMECs ، باستخدام نظام مقاومة كهربائية ظهاري فولت / أوم متر ، قم بتوصيل القطب بالعداد ، وقم بموازنة القطب الكهربائي عن طريق نقعه أولا في 70٪ من الإيثانول لمدة 15 إلى 20 دقيقة ثم غمره لفترة وجيزة في وسط نمو EGM لزراعة الخلايا. قم بإجراء قياس TEER عن طريق غمر القطب الكهربائي بعناية ، بحيث يكون الطرف الأقصر في الإدراج ويلامس الطرف الأطول قاع البئر. قم بقياس المقاومة عبر عنصر التحكم الفارغ أولا ، ثم لكل إدراج ، قم بقياس TEER في ثلاثة أضعاف.
عند الوصول إلى الالتقاء مع قيم TEER حوالي 20 أوم سنتيمتر مربع ، يحرم المصل الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون باستخدام 0.5٪ FBS في EBM في كلتا الغرفتين قبل العلاج بالليكاند. تم استخدام EBM المخفض في المصل طوال فترة الفحص. احتضن الخلايا باستخدام الوسط المختزل بالمصل في الغرفة القمية باستخدام علامة السيانين الفلورسنت 3-tag لنقل الليجند لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
بعد غسل الطبقة الأحادية بشكل قمي وباسولي 4 مرات باستخدام الوسط المختزل بالمصل ، أضف وسطا طازجا إلى إدخالات المرشح التي تحتوي على الخلايا وانقل الإدخالات إلى آبار جديدة من صفيحة 24 بئرا تحتوي على وسط مختزل بالمصل تم تسخينه مسبقا. احتضن الخلايا لمدة 90 دقيقة أخرى في الحاضنة ثم جمع الوسط من الغرفة القاعدية. سجل شدة التألق للمحلول من الغرفة القاعدية باستخدام كاشف التألق.
عند الوصول إلى الالتقاء مع قيم TEER حوالي 20 أوم سنتيمتر مربع ، يحرم المصل الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون باستخدام 0.5٪ FBS في EBM في كلتا الغرفتين قبل العلاج باستخدام الليكاند. تم استخدام EBM المخفض في المصل طوال فترة الفحص. بعد ذلك ، عالج الخلايا في الغرفة القمية بالعلاجات المطلوبة وضوابط السيارة.
أضف 5 ملليغرام لكل ملليلتر من بيروكسيديز الفجل ، أو HRP ، إلى الخلايا ، واحتضنها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أضف وسطا جديدا مخفضا للأمصال إلى الغرفة القمية وانقل الإدخالات إلى بئر طازجة تحتوي على وسائط مسبقة الاحترار. احتضن الطبقة الأحادية لمدة 90 دقيقة إضافية في الحاضنة.
بعد جمع الوسط من الغرفة القاعدية ، أضف 100 ميكرولتر من ركيزة البيروكسيديز الفلوروجينية HRP إلى الوسط الذي تم جمعه واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أوقف التفاعل باستخدام 100 ميكرولتر من محلول التوقف واكتشف مستويات منتج تفاعل الركيزة HRP في الوسائط باستخدام قارئ لوحة التألق. قبل إظهار اختبارات transcytosis في المختبر ، يتم عرض تصور transcytosis الخلايا البطانية في شبكية العين كمعلومات أساسية.
هنا ، تظهر صورة المجهر الضوئي تجويف الأوعية الدموية المملوء ب HRP من قسم شبكية العين للفأر من النوع البري البالغ من العمر 3 أشهر والملطخ ب DAB. تم حقن HRP بأثر رجعي في المدار. يمكن رؤية الأوعية الشبكية المملوءة ب HRP على أنها تترسب باللون البني الداكن تحت المجهر الضوئي.
يظهر قسم المجهر الإلكتروني الناقل الرقيق للغاية الأوعية العابرة للخلايا المملوءة ب HRP مع RMECs التي تصور ترانسسيتوزيس EC عبر حاجز الدم والشبكية الداخلي. هنا ، من المحتمل أن تعكس الحويصلة الكبيرة macropinosome وخلية دم حمراء على جانب اللومينول. تظهر صورة TeM حويصلات صغيرة عبر الخلايا مملوءة ب HRP ، من المحتمل أن تكون حويصلات كهفية ، داخل RMEC.
يوضح تلطيخ الكيمياء النسيجية المناعية للأجسام المضادة CAV-1 و isolectin B4 توطين CAV-1 ، وهي علامة على حويصلات الكهف في الأوعية الدموية الشبكية ، في شبكية العين من النوع البري من النوع البريدي البالغة من العمر 3 أشهر. تظهر صورة TeM ل CAV-1 المسمى بالذهب المناعي داخل الخلايا البطانية للشبكية هنا مع صورة مكبرة لحويصلة الكهف الإيجابية CAV-1. بالنسبة لفحص ترانسكسيتوسيس EC بوساطة الكلاثرين في HRMECs باستخدام transferrin، هنا، تظهر صورة المجهر الفلوري ترانسفيرين Cy3 المتكامل بلون أحمر داخل HRMECs ملطخة ب DAPI باللون الأزرق.
بالنسبة لانتقال الخلايا EC بوساطة الكهف باستخدام HRP ، يتم استخدام إشارات Wnt هنا كمثال لإثبات الفحص. تم العثور على إشارات Wnt مؤخرا لتنظيم ترانسكيتوسيس EC بوساطة الكهف. تمت معالجة الخلايا باستخدام منشط مسار Wnt Wnt3a المشروط المتوسط والمؤتلف Norrin، مع أو بدون مثبط إشارات Wnt XAV939 وضوابطها التفاعلية.
خفضت منشطات Wnt مستوى ترانسكيتوسيس القائم على HRP ، والتي تم عكسها بواسطة XAV939. يعد قياس TEER الصحيح أمرا بالغ الأهمية لتحديد سلامة الطبقة الأحادية. يتأثر بشكل كبير بعوامل مختلفة مثل التعامل غير السليم ، وتقلبات درجات الحرارة ، ووسط الثقافة ، ومدة الثقافة ، وما إلى ذلك.
يمكن تعديل هذا الفحص كثقافة مشتركة أو أنظمة ثقافة عضوية 3D تحاكي في ظروف الجسم الحي.
