Este protocolo proporciona un modelo basado en células útil para estudiar la función y la permeabilidad de las barreras vasculares selectivas, como la barrera hematoretiniana o la barrera hematoencefálica, con un enfoque específico en la transcitosis endotelial. Este ensayo es fácil de configurar y usar y no requiere animales vivos. Se puede utilizar para investigar varios reguladores moleculares de la permeabilidad de las células endoteliales y la transcitosis que afectan la integridad de la barrera interna sangre-retina.
Este ensayo puede proporcionar información sobre la biología vascular y la investigación ocular y cerebral, lo que permite una mejor comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes al control de la BB y explorar la posible administración de fármacos a través de las barreras. Para comenzar, prepare los insertos de filtro de cultivo celular para sembrar células endoteliales microvasculares de la retina humana o HRMEC, recubriendo cada inserto con 200 microlitros de solución de gelatina al 0,1% durante 30 minutos bajo una campana de flujo laminar. Asegúrese de que la solución cubra toda la superficie inferior del inserto del filtro.
Tome una placa de Petri con HRMECs cultivados incubados a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, y aspire los medios de crecimiento. Enjuague suavemente las células dos veces con 10 mililitros de 1X PBS debajo de la campana de flujo laminar para deshacerse de las posibles células flotantes o muertas. Disocie las células con 0,5 a 1 mililitro de solución de tripsina-EDTA al 0,25% y coloque la placa de Petri en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 5 minutos.
Apague la actividad de tripsina agregando de 4.5 a 9 mililitros de medios de crecimiento y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros usando una pipeta de 10 mililitros. Gire las celdas a 200 veces g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 mililitros de medios de crecimiento.
Cuente el número de células usando un hemocitómetro manual o un contador celular automatizado y siembre a una densidad de 40, 000 células por inserto de filtro. El volumen de suspensión celular para cada inserto es de 250 microlitros. Aspire la solución de recubrimiento de los pocillos que contienen insertos permeables y transfiera 250 microlitros de la suspensión celular por inserto, luego agregue solo medio a uno de los insertos, que se utilizará como control en blanco para la medición de la resistencia eléctrica transendotelial, o TEER.
Simultáneamente, también añadir 750 microlitros de medio por pocillo en las cámaras basolaterales. Mantenga la placa de 24 pocillos con insertos permeables en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 7 a 12 días hasta que las células cultivadas se vuelvan completamente confluentes y se logre el valor TEER deseado de alrededor de 20 ohmios por centímetro cuadrado. Antes de las mediciones TEER, coloque la placa de 24 pocillos que contiene la celda en la campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos para equilibrar la temperatura.
Para medir el TEER para HRMEC, utilizando un sistema de resistencia eléctrica del medidor epitelial voltio/ohmio, conecte el electrodo al medidor y equilibre el electrodo remojándolo primero en etanol al 70% durante 15 a 20 minutos y luego sumergiéndolo brevemente en el medio de crecimiento EGM de cultivo celular. Realice la medición TEER sumergiendo cuidadosamente el electrodo, de modo que la punta más corta esté en el inserto y la punta más larga toque el fondo del pozo. Mida primero la resistencia a través del control en blanco, luego para cada inserto, mida TEER por triplicado.
Al alcanzar la confluencia con valores TEER de alrededor de 20 ohmios centímetros cuadrados, privar de suero a las células durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono utilizando 0,5% FBS en EBM en ambas cámaras antes del tratamiento con el ligando. Se utilizó MBE reducida en suero durante todo el ensayo. Incubar las células usando el medio reducido en suero en la cámara apical con cianina-3-tag fluorescente a ligando transferrina durante 60 minutos a 37 grados centígrados.
Después de lavar la monocapa apical y basolateralmente 4 veces con el medio reducido en suero, agregue medio fresco a los insertos de filtro que contienen las células y transfiera los insertos a pocillos frescos de la placa de 24 pocillos que contiene medio reducido en suero precalentado. Incubar las células durante otros 90 minutos en la incubadora y luego recoger el medio de la cámara basolateral. Registre la intensidad de fluorescencia de la solución desde la cámara basolateral utilizando un detector de fluorescencia.
Al alcanzar la confluencia con valores TEER de alrededor de 20 ohmios centímetro cuadrado, privar de suero a las células durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono utilizando 0,5% FBS en EBM en ambas cámaras antes del tratamiento con el ligando. Se utilizó MBE reducida en suero durante todo el ensayo. A continuación, trate las células en la cámara apical con los tratamientos deseados y controles del vehículo.
Agregue 5 miligramos por mililitro de peroxidasa de rábano picante, o HRP, a las células e incube durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Agregue un medio fresco reducido en suero a la cámara apical y transfiera los insertos a un pocillo fresco que contenga medios precalentados. Incubar la monocapa durante 90 minutos adicionales en la incubadora.
Después de recolectar el medio de la cámara basolateral, agregue 100 microlitros de sustrato de peroxidasa fluorogénica HRP al medio recolectado e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Detenga la reacción con 100 microlitros de solución de parada y detecte los niveles de producto de reacción de sustrato HRP en el medio utilizando un lector de placas de fluorescencia. Antes de demostrar los ensayos de transcitosis in vitro, la visualización de la transcitosis de células endoteliales en la retina se muestra como información de fondo.
Aquí, la imagen del microscopio de luz muestra una luz de vaso sanguíneo llena de HRP de una sección retiniana de ratón de tipo salvaje de 3 meses de edad teñida con DAB. HRP fue inyectado retroorbitalmente. Los vasos retinianos llenos de HRP se pueden ver como precipitados de color marrón oscuro bajo el microscopio de luz.
La sección ultradelgada del microscopio electrónico de transmisión muestra vasos transcitóticos llenos de HRP con RMEC que representan transcitosis EC a través de la barrera interna de la sangre y la retina. Aquí, la vesícula grande refleja potencialmente macropinosoma y un glóbulo rojo en el lado del luminol. La imagen TeM muestra pequeñas vesículas transcitóticas llenas de HRP, probablemente vesículas caveola, dentro del RMEC.
La tinción inmunohistoquímica del anticuerpo CAV-1 y la isolectina B4 demuestra la localización de CAV-1, un marcador de vesículas caveola en los vasos sanguíneos de la retina, en la retina de ratón de tipo salvaje de 3 meses de edad. La imagen TeM de CAV-1 marcada con inmunooro dentro de las células endoteliales de la retina se muestra aquí con una imagen ampliada de la vesícula de caveola CAV-1 positiva. Para el ensayo de transcitosis EC mediada por clatrina en HRMEC utilizando transferrina, aquí, una imagen de microscopio de fluorescencia muestra transferrina Cy3 endocitosada en color rojo dentro de HRMEC teñidos con DAPI en azul.
Para la transcitosis EC mediada por caveolas utilizando HRP, la señalización Wnt aquí se usa como ejemplo para demostrar el ensayo. Recientemente se descubrió que la señalización Wnt regula la transcitosis EC mediada por caveolas. Las células fueron tratadas con el activador de la vía Wnt Wnt3a condicionado por el medio y Norrina recombinante, con o sin inhibidor de señalización Wnt XAV939 y sus controles reactivos.
Los activadores Wnt redujeron el nivel de la transcitosis basada en HRP, que fueron revertidas por XAV939. La medición correcta de TEER es crucial para determinar la integridad de la monocapa. Se ve muy afectado por diversos factores, como el manejo inadecuado, las fluctuaciones de temperatura, el medio de cultivo, la duración del cultivo, etc.
Este ensayo podría modificarse como cocultivo o sistemas de cultivo organotípico 3D que imitan las condiciones in vivo.
