这是第一个使用非洲绿松石鳉鱼的冷冻大脑分离高质量细胞核以进行单核测序实验的优化方案，这是一种用于衰老研究的新兴脊椎动物模型。该协议非常温和地分离细胞核，将其与针对具有更多髓鞘大脑的其他生物优化的更苛刻的方案区分开来，这会导致在鳉鱼中使用时细胞核退化。这种方法将有助于我们了解单细胞水平的大脑衰老。
它应该很好地转化为需要更温和的细胞核分离的其他组织。该协议是用户友好的。最苛刻的任务是用于去除碎屑的梯度离心，其中慢而精确比快速和凌乱更好。
演示该程序的将是Ari Adler和Brian Teefy，他是Benayoun实验室的研究实验室技术员和博士后学者。解剖鳉鱼后，将冷冻的脑组织在冰上解冻10分钟，然后将大脑弹入两毫升弹跳匀浆器中的一毫升冰冷的细胞核裂解缓冲液中。在裂解样品时，将均质器保持在冰上并避免产生气泡。
按照手稿中的描述弹跳组织，让样品在弹跳均质机中的冰上休息两分钟。然后，通过70微米的细胞过滤器将样品过滤到预涂有5%BSA的15毫升锥形管中。通过将洗涤缓冲液移液到70微米细胞过滤器上，向样品中加入4毫升细胞洗涤缓冲液，并通过轻轻倒置试管进行五次混合。
使用水平吊篮转子，在 4 摄氏度下以 500 G 离心样品 10 分钟。将上清液轻轻倒入废液容器中，将其丢弃。保持样品直立，并使用P1000移液器去除剩余的洗涤缓冲液。
立即用宽口径P1000移液器吸头将细胞核重悬于一毫升细胞核洗涤缓冲液中。然后，通过加入四毫升细胞核洗涤缓冲液将样品增加到五毫升，并如前所述进行混合。通过离心沉淀细胞。
弃去上清液，用宽口径移液器吸头将细胞核重悬于一毫升细胞核洗涤缓冲液中。现在，将细胞核转移到流式细胞术管中。向细胞悬液中加入300微升除屑溶液，并通过用宽口径吸头移液直至混合物均匀。
以轻微的角度握住试管，并使用P1000移液管将一毫升细胞核洗涤缓冲液轻轻覆盖在细胞核溶液的顶部。将样品在 3000 G 的摆动桶转子中以 4 摄氏度离心 10 分钟。使用 P1000 移液器完全丢弃前两相。
将底层转移到预涂有5%BSA的15毫升锥形管中。然后，用细胞核洗涤缓冲液将体积降至 15 毫升，并通过倒置试管三次混合。在摆动式桶转子中以 1000G 在 4 摄氏度下离心管 10 分钟。
小心地除去上清液，并立即使用宽口径移液器吸头将沉淀重悬于150微升的细胞核洗涤缓冲液中。切换到设置为 300 微升的标准孔径移液器吸头。移液整个样品，然后将一个40微米的吸头过滤器连接到移液器吸头的末端。
通过将样品通过过滤器强行排出到低DNA结合的1.5毫升微量离心管中来过滤样品。在FACS管中，将10微升过滤的细胞核样品重悬于90微升推荐的流式细胞术缓冲液中。用碘化丙啶对样品进行染色，最终浓度为每毫升一微克。
按照稿件中的说明设置工作区后，按右下角的播放图标开始流程。使用侧向散射区域与HDRT检查样品中的气泡或团块。此外，请检查侧向散点图与前向散点图，以验证事件是否在窗口边界内累积。
要获得放大视图，请双击侧向散射区域与 PerCP-Vio700-A 图。单击左上角工具栏上带有垂直线的按钮以选择象限门。然后，单击侧向散射区域中的任意位置与 PerCP-Vio700-A 图，象限将出现在图中。
单击象限分隔线上的任意位置，然后滑动光标以修改象限位置。放置象限，使左上象限包含碎片，右上象限包含细胞核。单击方形、灰色、I 图标以打开属性窗口。
转到区域函数选项卡，并确保顶部项目旁边有一个绿色复选标记，表示已选择整个图。在功能列表下，单击每微升计数以生成绿色复选标记。单击“确定”，每个象限将显示每微升指标的计数。
根据需要，从区域函数选项卡中选择计数和总计百分比以查看原始计数和百分比。通过单击左上角工具栏上的多边形按钮，在此人口周围绘制一个多边形门。然后，单击一次并滑动鼠标以绘制门的线性段。
再次单击以完成并开始下一个，然后双击以完成门。单击门的边框，然后滑动鼠标以重新定位门。单击门的顶点以修改形状，将显示每微升门控人口的计数。
以具有完整膜的单线态细胞核形式出现的健康细胞核适用于下游分析。然而，不健康的细胞核的特征是核膜受损，这会导致细胞核结块，并可能导致下游应用中的背景信号。细胞核在右上象限呈单重态和多重形式，单重态是事件的最低云，然后是双峰和三重体，按升序排列。
碎片以低质量核制备中最左边两个象限中的事件为标志，其中省略了碎片清除步骤。碎片占事件的40%以上。然而，在高质量的实验中，碎片占所有事件的不到15%。
必须在碎片去除离心步骤后完全去除中间层，以减少污染的背景RNA 使用该方案分离的细胞核可用于单核RNA测序或ATAC测序，以获得单细胞水平的转录组学和表观遗传学信息。这项技术将使研究人员能够在单细胞水平上探索非洲绿松石鳉鱼的大脑基因调控，非洲绿松石鳉鱼是一种用于衰老研究的天然短命脊椎动物模式生物。
