이것은 노화 연구를 위한 새로운 척추동물 모델인 아프리카 청록색 킬리피쉬의 냉동 뇌를 사용하는 단일 핵 시퀀싱 실험을 위한 고품질 핵 분리를 위한 최초의 최적화된 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 핵을 매우 부드럽게 분리하여 더 많은 수초가 있는 뇌를 가진 다른 유기체에 최적화된 더 가혹한 프로토콜과 구별되며, 이는 킬리피쉬에서 사용될 때 핵이 분해되는 결과를 초래합니다. 이 방법은 단일 세포 수준에서 뇌 노화를 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
더 부드러운 핵 분리가 필요한 다른 조직으로 잘 번역되어야합니다. 이 프로토콜은 사용자 친화적입니다. 가장 까다로운 작업은 파편 제거를위한 그라디언트 원심 분리로, 빠르고 지저분한 것보다 느리고 정확한 것이 좋습니다.
이 절차를 시연하는 것은 아리 애들러 (Ari Adler)와 브라이언 티피 (Brian Teefy), 연구실 기술자이자 베나 윤 연구소의 박사후 연구원입니다. 킬리 피쉬를 해부 한 후, 얼어 붙은 뇌 조직을 얼음에서 10 분 동안 해동하고 2 밀리리터 dounce 균질화기의 얼음처럼 차가운 핵 용해 완충액 1 밀리리터에 뇌를 담근다. 샘플을 용해하는 동안 균질화기를 얼음 위에 유지하고 기포가 발생하지 않도록 하십시오.
원고에 설명된 대로 조직을 두드리고 샘플을 dounce 균질화기의 얼음 위에 2분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 70마이크로미터 셀 필터를 통해 샘플을 5%BSA로 사전 코팅된 15밀리리터 원추형 튜브에 변형시킵니다. 70마이크로미터 세포 필터 위에 세척 버퍼를 피펫팅하여 샘플에 4밀리리터의 핵 세척 버퍼를 추가하고 튜브를 5회 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.
스윙 버킷 로터를 사용하여 섭씨 4도에서 10분 동안 500G의 샘플을 원심분리합니다. 상청액을 액체 폐기물 용기에 부드럽게 부어 버립니다. 샘플을 똑바로 세우고 P1000 피펫을 사용하여 남은 세척 버퍼를 제거합니다.
넓은 구멍의 P1000 피펫 팁으로 1 밀리리터의 핵 세척 완충액에 핵을 즉시 재현 탁하십시오. 그런 다음 4 밀리리터의 핵 세척 완충액을 추가하여 샘플을 5 밀리리터로 가져오고 이전에 설명 된대로 혼합하십시오. 원심분리에 의해 세포를 펠릿화한다.
상청액을 버리고 넓은 구멍의 피펫 팁으로 1 밀리리터의 핵 세척 완충액에 핵을 다시 현탁시킵니다. 이제 핵을 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 300마이크로리터의 파편 제거 용액을 세포 현탁액에 추가하고 혼합물이 균질해질 때까지 넓은 보어 팁으로 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
튜브를 약간 비스듬히 잡고 P1000 피펫을 사용하여 핵 용액 위에 1mg의 핵 세척 버퍼를 부드럽게 덮습니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 3000G의 스윙 버킷 로터에서 샘플을 원심분리합니다. P1000 피펫을 사용하여 상위 두 단계를 완전히 폐기하십시오.
하단 레이어를 5%BSA로 사전 코팅된 15밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 핵 세척 완충액으로 부피를 15 밀리리터로 가져오고 튜브를 세 번 뒤집어 혼합합니다. 스윙 버킷 로터에서 섭씨 4도에서 10분 동안 1000G에서 튜브를 원심분리합니다.
상청액을 조심스럽게 제거하고 넓은 보어 피펫 팁을 사용하여 150 마이크로리터의 핵 세척 완충액에 펠릿을 즉시 재현탁합니다. 300마이크로리터로 설정된 표준 보어 피펫 팁으로 전환합니다. 전체 샘플을 파이펫팅한 다음 40마이크로미터 팁식 필터를 파이펫 팁 끝에 부착합니다.
필터를 통해 샘플을 낮은 DNA 결합, 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 강제로 배출하여 샘플을 필터링합니다. FACS 튜브에서 여과된 핵 샘플 10마이크로리터를 권장 유세포분석 버퍼 90마이크로리터에 재현탁합니다. 샘플을 밀리리터당 1마이크로그램의 최종 농도로 요오드화프로피듐으로 염색합니다.
원고에 설명된 대로 작업 공간을 설정한 후 오른쪽 하단 모서리에 있는 재생 아이콘을 눌러 흐름을 시작합니다. 측면 산란 영역과 HDRT를 비교하여 샘플에 기포 또는 덩어리가 있는지 확인합니다. 또한 측면 산점도와 정방향 산점도를 비교하여 이벤트가 창 범위 내에서 누적되는지 확인합니다.
확대 보기의 경우 측면 분산 영역 대 PerCP-Vio700-A 플롯을 두 번 클릭합니다. 왼쪽 상단 도구 모음에서 수직선이 있는 버튼을 클릭하여 사분면 게이트를 선택합니다. 그런 다음 측면 분산 영역과 PerCP-Vio700-A 플롯의 아무 곳이나 클릭하면 플롯 내부에 사분면이 나타납니다.
사분면 구분선의 아무 곳이나 클릭하고 커서를 밀어 사분면 배치를 수정합니다. 왼쪽 상단 사분면에 파편이 있고 오른쪽 상단 사분면에 핵이 포함되도록 사분면을 배치합니다. 사각형, 회색, I 아이콘을 클릭하여 속성 창을 엽니다.
영역 기능 탭으로 이동하여 상단 항목 옆에 녹색 확인 표시가 있는지 확인하여 전체 플롯이 선택되었음을 나타냅니다. 함수 목록에서 마이크로리터당 개수를 클릭하여 녹색 확인 표시를 생성합니다. 확인을 클릭하면 각 사분면에 마이크로리터당 개수가 표시됩니다. 메트릭.
영역 함수 탭에서 카운트 및 백분율 합계를 선택하여 원하는 경우 원시 카운트와 백분율을 봅니다. 왼쪽 위 도구 모음에서 다각형 단추를 클릭하여 이 인구 주위에 다각형 게이트를 그립니다. 그런 다음 한 번 클릭하고 마우스를 밀어 게이트의 선형 세그먼트를 그립니다.
다시 클릭하여 완료하고 다음 게이트를 시작한 다음 두 번 클릭하여 게이트를 완료합니다. 게이트의 경계를 클릭하고 마우스를 밀어 게이트의 위치를 변경합니다. 게이트의 정점을 클릭하여 모양을 수정하면 게이트 모집단의 마이크로리터당 개수가 나타납니다.
손상되지 않은 막을 가진 단일 핵으로 나타난 건강한 핵은 다운 스트림 분석에 적합합니다. 그러나 건강에 해로운 핵은 손상된 핵막이 특징이며, 이는 핵 응집으로 이어지고 다운스트림 응용 분야의 배경 신호에 기여할 수 있습니다. 핵은 오른쪽 상단 사분면에 단일항 및 다중 형태이며, 단일 렛은 가장 낮은 이벤트 구름으로 이어지며 이중 및 삼중 항이 오름차순으로 이어집니다.
파편은 파편 제거 단계가 생략된 저품질 핵 준비에서 가장 왼쪽 두 사분면의 이벤트로 표시됩니다. 파편은 사건의 40 % 이상을 차지합니다. 그러나 고품질 실험에서 파편은 모든 사건의 15 % 미만을 차지합니다.
오염을 줄이기 위해 파편 제거 원심분리 단계 후 중간층을 완전히 제거하는 것이 필수적입니다. 이 프로토콜을 사용하여 분리된 핵은 단일 세포 수준의 전사체 및 후성유전학적 정보를 얻기 위해 단일 핵 RNA 시퀀싱 또는 ATAC 시퀀싱에 사용할 수 있습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 노화 연구를위한 자연적으로 수명이 짧은 척추 동물 모델 유기체 인 아프리카 청록색 킬리 피쉬의 단일 세포 수준에서 뇌 유전자 조절을 탐구 할 수 있습니다.
