Dies ist das erste optimierte Protokoll zur Isolierung hochwertiger Kerne für Einzelkernsequenzierungsexperimente mit gefrorenen Gehirnen afrikanischer türkisfarbener Killifische, einem aufstrebenden Wirbeltiermodell für die Alternsforschung. Dieses Protokoll isoliert Kerne sehr schonend, was es von härteren Protokollen unterscheidet, die für andere Organismen mit myelinisierteren Gehirnen optimiert sind, die bei Verwendung im Killifisch zu abgebauten Kernen führen. Diese Methode wird uns helfen, die Alterung des Gehirns auf Einzelzellebene zu verstehen.
Es sollte sich gut auf andere Gewebe übertragen lassen, die eine schonendere Kernisolierung erfordern. Dieses Protokoll ist benutzerfreundlich. Die anspruchsvollste Aufgabe ist die Gradientenzentrifugation zur Schmutzentfernung, bei der es besser ist, langsam und genau zu sein als schnell und unordentlich.
Ari Adler und Brian Teefy, ein Forschungslabortechniker und Postdoktorand aus dem Benayoun-Labor, demonstrieren das Verfahren. Nach dem Sezieren der Killifische das gefrorene Hirngewebe auf Eis für 10 Minuten auftauen und das Gehirn in einem Milliliter eiskalten Kern-Lysepuffer in einem Zwei-Milliliter-Düsterhomogenisator abstoßen. Halten Sie den Homogenisator während des Lysierens der Probe auf Eis und vermeiden Sie die Erzeugung von Blasen.
Treten Sie das Gewebe wie im Manuskript beschrieben ab und lassen Sie die Probe zwei Minuten auf Eis im Dounce-Homogenisator ruhen. Anschließend wird die Probe durch einen 70-Mikrometer-Zellfilter in ein 15-Milliliter-konisches Röhrchen gesiebt, das mit 5% BSA vorbeschichtet ist. Fügen Sie der Probe vier Milliliter Kernwaschpuffer hinzu, indem Sie den Waschpuffer über den 70-Mikrometer-Zellfilter pipettieren und durch fünfmaliges Umdrehen des Röhrchens mischen.
Zentrifugieren Sie die Probe mit einem schwingenden Schaufelrotor bei 500 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie ihn vorsichtig in einen flüssigen Abfallbehälter gießen. Halten Sie die Probe aufrecht und entfernen Sie den restlichen Waschpuffer mit einer P1000-Pipette.
Die Kerne werden sofort in einem Milliliter Kernwaschpuffer mit einer P1000-Pipettenspitze mit breiter Bohrung resuspendiert. Dann bringen Sie die Probe auf fünf Milliliter, indem Sie vier Milliliter Kernwaschpuffer hinzufügen und wie zuvor demonstriert mischen. Pelletieren Sie die Zelle durch Zentrifugieren.
Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Kerne in einem Milliliter Kernwaschpuffer mit einer breiten Pipettenspitze. Übertragen Sie nun die Kerne in ein Durchflusszytometrieröhrchen. Fügen Sie der Zellsuspension 300 Mikroliter Schmutzentfernungslösung hinzu und mischen Sie sie gründlich durch Pipettieren mit einer breiten Bohrungsspitze, bis die Mischung homogen ist.
Halten Sie das Röhrchen in einem leichten Winkel und legen Sie vorsichtig einen Milliliter Kernwaschpuffer mit einer P1000-Pipette auf die Kernlösung. Zentrifugieren Sie die Probe in einem schwingenden Schaufelrotor bei 3000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie die oberen beiden Phasen vollständig mit einer P1000-Pipette.
Übertragen Sie die untere Schicht in ein 15-Milliliter-konisches Rohr, das mit 5% BSA vorbeschichtet ist. Dann bringen Sie das Volumen mit Kernwaschpuffer auf 15 Milliliter und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen dreimal umdrehen. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1000G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius in einem schwingenden Schaufelrotor.
Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Pellet sofort in 150 Mikroliter Kernwaschpuffer mit einer breiten Pipettenspitze. Wechseln Sie zu einer Standard-Pipettenspitze mit 300 Mikrolitern. Pipetten Sie die gesamte Probe und befestigen Sie dann einen 40-Mikrometer-Filter am Ende der Pipettenspitze.
Filtern Sie die Probe, indem Sie die Probe gewaltsam durch den Filter in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger DNA-Bindung ausstoßen. In einem FACS-Röhrchen werden 10 Mikroliter der gefilterten Kernprobe in 90 Mikrolitern des empfohlenen Durchflusszytometriepuffers resuspendiert. Färben Sie die Proben mit Propidiumiodid in einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter.
Nachdem Sie den Arbeitsbereich wie im Manuskript beschrieben eingerichtet haben, starten Sie den Ablauf, indem Sie auf das Play-Symbol in der unteren rechten Ecke klicken. Überprüfen Sie, ob Luftblasen oder -klumpen in der Probe verwendet werden, indem Sie den Seitenstreubereich im Vergleich zu HDRT verwenden. Überprüfen Sie außerdem das Seitenstreudiagramm im Vergleich zum Vorwärtsstreudiagramm, um sicherzustellen, dass sich die Ereignisse innerhalb der Fenstergrenzen ansammeln.
Doppelklicken Sie für eine vergrößerte Ansicht auf den Seitenstreubereich im Vergleich zum PerCP-Vio700-A-Diagramm. Klicken Sie auf die Schaltfläche in der oberen linken Symbolleiste mit einer senkrechten Linie, um ein Quadrantentor auszuwählen. Klicken Sie dann auf eine beliebige Stelle im Seitenstreubereich im Vergleich zum PerCP-Vio700-A-Diagramm, und Quadranten werden innerhalb des Diagramms angezeigt.
Klicken Sie auf eine beliebige Stelle der Quadrantentrennlinien, und schieben Sie den Cursor, um die Quadrantenplatzierung zu ändern. Platzieren Sie die Quadranten so, dass der obere linke Quadrant Trümmer und der obere rechte Quadrant Kerne enthält. Klicken Sie auf das quadratische, graue I-Symbol, um das Eigenschaftenfenster zu öffnen.
Gehen Sie zur Registerkarte Bereichsfunktionen und sorgen Sie für ein grünes Häkchen neben dem obersten Element, das anzeigt, dass das gesamte Diagramm ausgewählt ist. Klicken Sie in der Funktionsliste auf Anzahl pro Mikroliter, um ein grünes Häkchen zu erzeugen. Klicken Sie auf OK, und jeder Quadrant zeigt eine Anzahl pro Mikroliter-Metrik an.
Wählen Sie auf der Registerkarte Regionsfunktionen die Option Anzahl und Gesamtprozent aus, um bei Bedarf Rohzählungen und Prozentsätze anzuzeigen. Zeichnen Sie ein polygonales Tor um diese Population, indem Sie auf die Polygonschaltfläche in der Symbolleiste oben links klicken. Klicken Sie dann ein einzelnes Mal und schieben Sie die Maus, um ein lineares Segment des Tors zu zeichnen.
Klicken Sie erneut, um den Vorgang abzuschließen und den nächsten zu beginnen, gefolgt von einem Doppelklick, um das Tor zu beenden. Klicken Sie auf den Rand des Tors und schieben Sie die Maus, um das Tor neu zu positionieren. Klicken Sie auf die Scheitelpunkte des Tors, um die Form zu ändern, und die Anzahl pro Mikroliter der Gated Population wird angezeigt.
Gesunde Kerne, die als Singulettkerne mit intakten Membranen erschienen sind, eignen sich für die nachgeschaltete Analyse. Ungesunde Kerne zeichnen sich jedoch durch beschädigte Kernmembranen aus, was zu einer Verklumpung der Kerne führt und zu Hintergrundsignalen in nachgeschalteten Anwendungen beitragen kann. Kerne sind in Singulett- und Multipletform im oberen rechten Quadranten, mit Sintagen als unterste Ereigniswolke, gefolgt von Dubletten und Tripletten in aufsteigender Reihenfolge.
Trümmer sind durch Ereignisse in den beiden linken Quadranten in einer minderwertigen Kernpräparation gekennzeichnet, bei denen der Schritt zur Entfernung von Trümmern weggelassen wurde. Trümmer machen mehr als 40% der Ereignisse aus. In einem qualitativ hochwertigen Experiment machen Trümmer jedoch weniger als 15% aller Ereignisse aus.
Es ist unerlässlich, die mittlere Schicht nach dem Zentrifugationsschritt zur Entfernung von Trümmern vollständig zu entfernen, um die kontaminierende Hintergrund-RNA zu reduzieren Kerne, die mit diesem Protokoll isoliert wurden, können für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung oder ATAC-Sequenzierung verwendet werden, um transkriptomische und epigenetische Informationen auf Einzelzellebene zu erhalten. Diese Technik wird es den Forschern ermöglichen, die Genregulation des Gehirns auf Einzelzellebene im afrikanischen türkisfarbenen Killifisch zu erforschen, einem natürlich kurzlebigen Wirbeltiermodellorganismus für die Alternsforschung.
