Bu, yaşlanma araştırmaları için ortaya çıkan bir omurgalı modeli olan Afrika turkuaz killifish'in donmuş beyinlerini kullanarak tek çekirdekli dizileme deneyleri için yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için ilk optimize edilmiş protokoldür. Bu protokol, çekirdekleri çok nazikçe izole eder, bu da onu daha miyelinli beyinlere sahip diğer organizmalar için optimize edilmiş daha sert protokollerden ayırır, bu da killifish'te kullanıldığında bozulmuş çekirdeklere neden olur. Bu yöntem, beyin yaşlanmasını tek hücre düzeyinde anlamamıza yardımcı olmada etkili olacaktır.
Daha yumuşak çekirdek izolasyonu gerektiren diğer dokulara iyi tercüme edilmelidir. Bu protokol kullanıcı dostudur. En zorlu görev, hızlı ve dağınık olmaktan ziyade yavaş ve kesin olmanın daha iyi olduğu enkaz kaldırma için gradyan santrifüjlemedir.
Prosedürü gösterenler, bir araştırma laboratuvarı teknisyeni ve Benayoun laboratuvarından doktora sonrası bir akademisyen olan Ari Adler ve Brian Teefy olacak. Kilifish'i diseke ettikten sonra, donmuş beyin dokusunu 10 dakika boyunca buz üzerinde çözün ve beyni iki mililitrelik bir sıçrama homojenizatöründe bir mililitre buz gibi soğuk çekirdek lizis tamponunda sıçrayın. Numuneyi lize ederken, homojenizatörü buz üzerinde tutun ve kabarcık oluşturmaktan kaçının.
Dokuyu el yazmasında açıklandığı gibi zıplatın ve numunenin iki dakika boyunca sıçrama homojenizatöründe buz üzerinde durmasına izin verin. Ardından, numuneyi 70 mikrometrelik bir hücre filtresinden %5 BSA ile önceden kaplanmış 15 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Yıkama tamponunu 70 mikrometrelik hücre filtresinin üzerine pipetleyerek numuneye dört mililitre çekirdek yıkama tamponu ekleyin ve tüpü beş kez hafifçe ters çevirerek karıştırın.
Sallanan bir kova rotoru kullanarak, numuneyi dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 500 G'de santrifüj yapın. Süpernatantı yavaşça bir sıvı atık haznesine dökerek atın. Numuneyi dik tutun ve kalan yıkama tamponunu P1000 pipet kullanarak çıkarın.
Çekirdekleri, geniş delikli P1000 pipet ucu ile bir mililitre çekirdek yıkama tamponunda derhal yeniden askıya alın. Ardından, dört mililitre çekirdek yıkama tamponu ekleyerek numuneyi beş mililitreye getirin ve daha önce gösterildiği gibi karıştırın. Santrifüjleme ile hücreyi topaklayın.
Süpernatantı atın ve çekirdekleri geniş delikli pipet ucu ile bir mililitre çekirdek yıkama tamponunda yeniden askıya alın. Şimdi, çekirdekleri bir akış sitometri tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonuna 300 mikrolitre döküntü giderme çözeltisi ekleyin ve karışım homojen olana kadar geniş bir delik ucu ile pipetleme yaparak iyice karıştırın.
Tüpü hafif bir açıyla tutun ve bir P1000 pipet kullanarak çekirdek çözeltisinin üzerine bir mililitre çekirdek yıkama tamponunu yavaşça yerleştirin. Numuneyi 3000 G'de sallanan bir kova rotorunda dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj yapın. P1000 pipet kullanarak üstteki iki fazı tamamen atın.
Alt katmanı% 5 BSA ile önceden kaplanmış 15 mililitrelik bir konik boruya aktarın. Ardından, çekirdek yıkama tamponu ile hacmi 15 mililitreye getirin ve tüpü üç kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü 1000G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca sallanan bir kova rotorunda santrifüj yapın.
Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve geniş delikli bir pipet ucu kullanarak peleti 150 mikrolitre çekirdek yıkama tamponunda derhal yeniden askıya alın. 300 mikrolitreye ayarlanmış standart bir delik pipet ucuna geçin. Tüm numuneyi pipetledikten sonra pipet ucunun ucuna 40 mikrometrelik bir uç filtresi takın.
Numuneyi filtreden düşük DNA bağlayıcı, 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne zorla dışarı atarak numuneyi filtreleyin. Bir FACS tüpünde, filtrelenmiş çekirdek örneğinin 10 mikrolitresini, önerilen akış sitometri tamponunun 90 mikrolitresinde yeniden askıya alın. Numuneleri propidium iyodür ile mililitre başına bir mikrogramlık son konsantrasyonda sabitleyin.
Çalışma alanını makalede açıklandığı gibi ayarladıktan sonra, sağ alt köşedeki oynat simgesine basarak akışı başlatın. HDRT'ye karşı yan saçılma alanını kullanarak numunedeki hava kabarcıkları veya kümeleri olup olmadığını kontrol edin. Ayrıca, olayların pencerenin sınırları içinde biriktiğini doğrulamak için yan dağılım ve ileri dağılım grafiğini kontrol edin.
Büyütülmüş bir görünüm için, PerCP-Vio700-A grafiğine karşı yan dağılım alanını çift tıklatın. Bir kadran kapısı seçmek için sol üst araç çubuğundaki dikey çizgili düğmeyi tıklatın. Ardından, PerCP-Vio700-A grafiğine karşı yan dağılım alanında herhangi bir yeri tıklattığınızda, grafiğin içinde kadranlar görünecektir.
Çeyrek bölme çizgilerinde herhangi bir yeri tıklatın ve çeyrek yerleşimini değiştirmek için imleci kaydırın. Kadranları sol üst kadran enkaz içerecek ve sağ üst kadran çekirdek içerecek şekilde yerleştirin. Özellikler penceresini açmak için kare, gri, I simgesine tıklayın.
Bölge işlevleri sekmesine gidin ve üst öğenin yanında, grafiğin tamamının seçili olduğunu belirten yeşil bir onay işareti olduğundan emin olun. İşlevler listesinin altında, yeşil bir onay işareti oluşturmak için mikrolitre başına sayıma tıklayın. Tamam'ı tıkladığınızda her kadran mikrolitre metrik başına bir sayı görüntüler.
İsterseniz ham sayıları ve yüzdeleri görüntülemek için bölge işlevleri sekmesinden sayı ve yüzde toplamı'nı seçin. Sol üst araç çubuğundaki çokgen düğmesini tıklatarak bu popülasyonun etrafına çokgen bir kapı çizin. Ardından, tek bir kez tıklayın ve kapının doğrusal bir bölümünü çizmek için fareyi kaydırın.
Bitirmek ve bir sonrakine başlamak için tekrar tıklayın, ardından kapıyı bitirmek için çift tıklayın. Kapının kenarlığını tıklatın ve kapıyı yeniden konumlandırmak için fareyi kaydırın. Şekli değiştirmek için kapının köşelerine tıklayın ve kapılı popülasyonun mikrolitresi başına sayımlar görünecektir.
Sağlam membranlara sahip singlet çekirdekleri olarak ortaya çıkan sağlıklı çekirdekler, aşağı akış analizi için uygundur. Bununla birlikte, sağlıksız çekirdekler, çekirdeklerin kümelenmesine yol açan ve aşağı akış uygulamalarında arka plan sinyallerine katkıda bulunabilen hasarlı nükleer membranlarla karakterizedir. Çekirdekler sağ üst kadranda tekli ve çarpan formlardadır, en düşük olay bulutu olarak tekiller ve ardından artan sırayla çiftler ve üçüzler gelir.
Enkaz, enkaz kaldırma adımının atlandığı düşük kaliteli bir çekirdek preparatındaki en soldaki iki kadrandaki olaylarla işaretlenir. Enkaz, olayların% 40'ından fazlasını oluşturur. Bununla birlikte, yüksek kaliteli bir deneyde, enkaz tüm olayların% 15'inden azını oluşturur.
Kirletici arka plan RNA Çekirdeklerini azaltmak için enkaz kaldırma santrifüjleme adımını takiben orta tabakanın tamamen çıkarılması zorunludur Bu protokol kullanılarak izole edilen RNA çekirdekleri, tek hücreli RNA dizilimi veya tek hücre düzeyinde transkriptomik ve epigenetik bilgi elde etmek için ATAC dizilimi için kullanılabilir. Bu teknik, araştırmacıların yaşlanma araştırmaları için doğal olarak kısa ömürlü bir omurgalı model organizması olan Afrika turkuaz killifish'te tek hücre düzeyinde beyin gen düzenlemesini keşfetmelerini sağlayacaktır.
