Este es el primer protocolo optimizado para aislar núcleos de alta calidad para experimentos de secuenciación de núcleos únicos utilizando cerebros congelados de killi turquesa africano, un modelo emergente de vertebrados para la investigación del envejecimiento. Este protocolo aísla los núcleos muy suavemente, lo que lo distingue de los protocolos más duros optimizados para otros organismos con cerebros más mielinizados, que resultan en núcleos degradados cuando se usan en el killifish. Este método será fundamental para ayudarnos a comprender el envejecimiento cerebral a nivel de una sola célula.
Debe traducirse bien a otros tejidos que requieren un aislamiento más suave de los núcleos. Este protocolo es fácil de usar. La tarea más exigente es la centrifugación de gradiente para la eliminación de escombros, en la que es mejor ser lento y exacto que rápido y desordenado.
Demostrando el procedimiento estarán Ari Adler y Brian Teefy, un técnico de laboratorio de investigación y un becario postdoctoral del laboratorio Benayoun. Después de diseccionar el killifish, descongele el tejido cerebral congelado en hielo durante 10 minutos y rebote el cerebro en un mililitro de tampón de lisis de núcleos helados en un homogeneizador de dos mililitros. Mientras lisa la muestra, mantenga el homogeneizador en hielo y evite generar burbujas.
Rebote el tejido como se describe en el manuscrito y deje reposar la muestra sobre hielo en el homogeneizador de rebote durante dos minutos. Luego, cuele la muestra a través de un filtro celular de 70 micrómetros en un tubo cónico de 15 mililitros prerecubierto con BSA al 5%. Agregue cuatro mililitros de tampón de lavado de núcleos a la muestra pipeteando el tampón de lavado sobre el filtro celular de 70 micrómetros y mezcle invirtiendo suavemente el tubo cinco veces.
Usando un rotor de cangilón oscilante, centrifugar la muestra a 500 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante vertiéndolo suavemente en un recipiente de desechos líquidos. Mantenga la muestra en posición vertical y retire el tampón de lavado restante con una pipeta P1000.
Inmediatamente resuspenda los núcleos en un mililitro de tampón de lavado de núcleos con una punta de pipeta P1000 de diámetro ancho. Luego, lleve la muestra a cinco mililitros agregando cuatro mililitros de tampón de lavado de núcleos y mezcle como se demostró anteriormente. Granular la célula por centrifugación.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los núcleos en un mililitro de tampón de lavado de núcleos con una punta de pipeta de diámetro ancho. Ahora, transfiera los núcleos a un tubo de citometría de flujo. Agregue 300 microlitros de solución de eliminación de residuos a la suspensión celular y mezcle bien pipeteando con una punta de diámetro ancho hasta que la mezcla sea homogénea.
Sostenga el tubo en un ligero ángulo y superponga suavemente un mililitro de tampón de lavado de núcleos sobre la solución de núcleos con una pipeta P1000. Centrifugar la muestra en un rotor de cangilón oscilante a 3000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche completamente las dos fases superiores con una pipeta P1000.
Transfiera la capa inferior a un tubo cónico de 15 mililitros prerecubierto con 5% de BSA. Luego, lleve el volumen a 15 mililitros con tampón de lavado de núcleos y mezcle invirtiendo el tubo tres veces. Centrifugar el tubo a 1000G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados en un rotor de cangilón oscilante.
Retire el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender inmediatamente el pellet en 150 microlitros de tampón de lavado de núcleos con una punta de pipeta de diámetro ancho. Cambie a una punta de pipeta de orificio estándar ajustada a 300 microlitros. Pipetear toda la muestra y, a continuación, conectar un filtro de punta de 40 micrómetros al extremo de la punta de la pipeta.
Filtre la muestra expulsándola a la fuerza a través del filtro en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros de baja unión al ADN. En un tubo FACS, resuspender 10 microlitros de la muestra de núcleos filtrados en 90 microlitros del tampón de citometría de flujo recomendado. Manchar las muestras con yoduro de propidio a una concentración final de un microgramo por mililitro.
Después de configurar el espacio de trabajo como se describe en el manuscrito, inicie el flujo presionando el icono de reproducción en la esquina inferior derecha. Compruebe si hay burbujas o grumos de aire en la muestra utilizando el área de dispersión lateral frente a HDRT. Además, compruebe el gráfico de dispersión lateral frente a dispersión directa para comprobar que los eventos se acumulan dentro de los límites de la ventana.
Para obtener una vista ampliada, haga doble clic en el área de dispersión lateral frente a la gráfica PerCP-Vio700-A. Haga clic en el botón de la barra de herramientas superior izquierda con una línea perpendicular para seleccionar una puerta de cuadrante. A continuación, haga clic en cualquier lugar del área de dispersión lateral frente a la gráfica PerCP-Vio700-A y aparecerán cuadrantes dentro de la gráfica.
Haga clic en cualquier lugar de las líneas divisorias del cuadrante y deslice el cursor para modificar la ubicación del cuadrante. Coloque los cuadrantes de tal manera que el cuadrante superior izquierdo contenga escombros y el cuadrante superior derecho contenga núcleos. Haga clic en el icono cuadrado, gris, I para abrir la ventana de propiedades.
Vaya a la pestaña de funciones de región y asegúrese de que haya una marca de verificación verde junto al elemento superior, lo que indica que se ha seleccionado todo el trazado. En la lista de funciones, haga clic en contar por microlitro para producir una marca de verificación verde. Haga clic en Aceptar y cada cuadrante mostrará una métrica de recuento por microlitro.
Seleccione el recuento y el porcentaje total en la pestaña de funciones de región para ver los recuentos sin procesar y los porcentajes si lo desea. Dibuje una puerta poligonal alrededor de esta población haciendo clic en el botón polígono de la barra de herramientas superior izquierda. A continuación, haga clic una sola vez y deslice el ratón para dibujar un segmento lineal de la puerta.
Haga clic de nuevo para finalizar y comenzar el siguiente, seguido de un doble clic para finalizar la puerta. Haga clic en el borde de la puerta y deslice el ratón para cambiar la posición de la puerta. Haga clic en los vértices de la puerta para modificar la forma, y aparecerán los recuentos por microlitro de la población cerrada.
Los núcleos sanos que aparecieron como núcleos singletes con membranas intactas son adecuados para el análisis posterior. Sin embargo, los núcleos no saludables se caracterizan por membranas nucleares dañadas, lo que conduce a la aglutinación de los núcleos y puede contribuir a las señales de fondo en aplicaciones posteriores. Los núcleos están en forma de singlete y multiplete en el cuadrante superior derecho, con singletes como la nube más baja de eventos seguidos de dobletes y tripletes en orden ascendente.
Los desechos están marcados por eventos en los dos cuadrantes más a la izquierda en una preparación de núcleos de baja calidad donde se omitió el paso de eliminación de desechos. Los escombros constituyen más del 40% de los eventos. Sin embargo, en un experimento de alta calidad, los desechos representan menos del 15% de todos los eventos.
Es imperativo eliminar completamente la capa intermedia siguiendo el paso de centrifugación de eliminación de escombros para reducir el fondo contaminante Los núcleos aislados utilizando este protocolo se pueden usar para la secuenciación de ARN de un solo núcleo o la secuenciación ATAC para obtener información transcriptómica y epigenética a nivel de una sola célula. Esta técnica permitirá a los investigadores explorar la regulación de genes cerebrales a nivel unicelular en el killi turquesa africano, un organismo modelo de vertebrados de vida naturalmente corta para la investigación del envejecimiento.
