זהו הפרוטוקול הממוטב הראשון לבידוד גרעינים איכותיים לניסויי ריצוף של גרעין יחיד באמצעות מוחות קפואים של דגי קירקיז אפריקאים, מודל מתפתח של בעלי חוליות לחקר ההזדקנות. פרוטוקול זה מבודד גרעינים בעדינות רבה, מה שמבדיל אותו מפרוטוקולים קשים יותר המותאמים לאורגניזמים אחרים עם יותר מוחות מיאלינים, מה שגורם לגרעינים מושפלים כאשר משתמשים בהם בדגי הקילין. שיטה זו תסייע לנו להבין את הזדקנות המוח ברמה של תא בודד.
זה צריך לתרגם היטב לרקמות אחרות הדורשות בידוד גרעינים עדין יותר. פרוטוקול זה ידידותי למשתמש. המשימה התובענית ביותר היא צנטריפוגה הדרגתית להסרת פסולת, שבה עדיף להיות איטי ומדויק מאשר מהיר ומבולגן.
מי שידגימו את ההליך יהיו ארי אדלר ובריאן טיפי, טכנאי מעבדת מחקר ופוסט-דוקטורנט ממעבדת בניון. לאחר ניתוח דגי הקילין, הפשירו את רקמת המוח הקפואה על הקרח למשך 10 דקות ודחפו את המוח במיליליטר אחד של חיץ ליזיס גרעיני קרח קרים בהומוגנייזר של שני מיליליטר. תוך כדי שכיבה של הדגימה, השאירו את ההומוגנייזר על הקרח והימנעו מיצירת בועות.
הזיזו את הרקמה כפי שמתואר בכתב היד ותנו לדגימה לנוח על הקרח בהומוגנייזר של ה-dounce למשך שתי דקות. לאחר מכן, מסננים את הדגימה דרך מסנן תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר המצופה מראש ב-5% BSA. הוסף ארבעה מיליליטר של חיץ שטיפת גרעינים לדגימה על ידי העברת חיץ הכביסה מעל מסנן התאים בגודל 70 מיקרומטר וערבב על ידי היפוך עדין של הצינור חמש פעמים.
באמצעות רוטור דלי מתנדנד, צנטריפוגה הדגימה ב 500 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נטנט על ידי שפיכתו בעדינות לתוך כלי קיבול לפסולת נוזלית. שמור את הדגימה זקופה והסר את מאגר הכביסה שנותר באמצעות פיפטה P1000.
מיד להשעות את הגרעינים במיליליטר אחד של מאגר שטיפת גרעינים עם קצה פיפטה P1000 רחב משעמם. לאחר מכן, הביאו את הדגימה לחמישה מיליליטרים על ידי הוספת ארבעה מיליליטרים של מאגר שטיפת גרעינים וערבבו כפי שהוכח קודם לכן. גלולה את התא על ידי צנטריפוגה.
השליכו את הסופר-נאטנט והניחו מחדש את הגרעינים במיליליטר אחד של חיץ שטיפת גרעינים עם קצה פיפטה רחב של משעמם. כעת, העבירו את הגרעינים לצינור ציטומטריה של זרימה. הוסיפו 300 מיקרוליטרים של תמיסת סילוק פסולת לתבשיל התא וערבבו היטב על ידי צנרת עם קצה בור רחב עד שהתערובת הומוגנית.
החזק את הצינור בזווית קלה, ושכב בעדינות מיליליטר אחד של חיץ שטיפת גרעינים על גבי תמיסת הגרעינים באמצעות פיפטה P1000. צנטריפוגה את הדגימה ברוטור דלי מתנדנד ב 3000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בטל לחלוטין את שני השלבים העליונים באמצעות פיפטה P1000.
מעבירים את השכבה התחתונה לצינור חרוטי בקוטר 15 מיליליטר המצופה מראש ב-5% BSA. לאחר מכן, הביאו את הנפח ל-15 מיליליטר עם חיץ שטיפת גרעינים וערבבו על ידי היפוך הצינור שלוש פעמים. צנטריפוגה את הצינור ב 1000G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד.
הסר את הסופר-נאטנט בזהירות ומיד תשהה את הכדור ב-150 מיקרוליטרים של חיץ שטיפת גרעינים באמצעות קצה פיפטה רחב. עברו לקצה פיפטה סטנדרטי שנקבע ל-300 מיקרוליטרים. צמחו את כל הדגימה ולאחר מכן, חברו מסנן של 40 מיקרומטר על הקצה לקצה קצה הפיפטה.
סנן את הדגימה על ידי גירוש בכוח של הדגימה דרך המסנן לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נמוך של DNA, 1.5 מיליליטר. בצינור FACS, יש לתלות מחדש 10 מיקרוליטרים של דגימת הגרעינים המסוננים ב-90 מיקרוליטרים של מאגר הציטומטריה המומלץ לזרימה. הכתימו את הדגימות בפרופידיום יודיד בריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר.
לאחר הגדרת סביבת העבודה כמתואר בכתב היד, התחל את הזרימה על-ידי לחיצה על סמל ההפעלה בפינה השמאלית התחתונה. בדוק אם יש בועות אוויר או גושים בדגימה באמצעות אזור הפיזור הצדדי לעומת HDRT. כמו כן, בדוק את תרשים הפיזור הצדדי לעומת הפיזור קדימה כדי לוודא שהאירועים מצטברים בתוך גבולות החלון.
לתצוגה מוגדלת, לחץ פעמיים על אזור הפיזור הצדדי לעומת תרשים PerCP-Vio700-A. לחץ על הלחצן בסרגל הכלים השמאלי העליון עם קו מאונך כדי לבחור שער מרובע. לאחר מכן, לחץ במקום כלשהו באזור הפיזור הצדדי לעומת תרשים PerCP-Vio700-A, ומרובעים יופיעו בתוך העלילה.
לחץ במקום כלשהו על הקווים המפרידים בין הרבעים והחלק את הסמן כדי לשנות את מיקום הרבע. מקם את הרבעים כך שהרבע השמאלי העליון מכיל פסולת והרביע הימני העליון מכיל גרעינים. לחץ על סמל הריבוע, האפור, I כדי לפתוח את חלון המאפיינים.
עבור אל הכרטיסייה פונקציות אזור וודא סימן ביקורת ירוק ליד הפריט העליון, המציין כי העלילה כולה נבחרה. תחת רשימת הפונקציות, לחץ על ספירה למיקרוליטר כדי לייצר סימן ביקורת ירוק. לחץ על אישור, וכל רביע יציג ספירה לכל מדד מיקרוליטר.
בחר 'ספירה' ו'אחוז סכום כולל' מהכרטיסיה 'פונקציות אזור' כדי להציג ספירות גולמיות ואחוזים, אם תרצה בכך. צייר שער מצולע סביב אוכלוסייה זו על-ידי לחיצה על לחצן המצולע בסרגל הכלים השמאלי העליון. לאחר מכן, לחץ פעם אחת והחלק את העכבר כדי לצייר קטע ליניארי של השער.
לחץ שוב כדי לסיים ולהתחיל את השער הבא, ולאחר מכן לחץ פעמיים כדי לסיים את השער. לחץ על גבול השער והחלק את העכבר כדי למקם מחדש את השער. לחץ על הקודקודים של השער כדי לשנות את הצורה, וספירות למיקרוליטר של האוכלוסייה המגודרת יופיעו.
גרעינים בריאים שהופיעו כגרעיני סינגלט עם ממברנות שלמות מתאימים לניתוח במורד הזרם. עם זאת, גרעינים לא בריאים מאופיינים בממברנות גרעיניות פגומות, מה שמוביל להיווצרות גרעינים ויכול לתרום לאותות רקע ביישומים במורד הזרם. גרעינים הם בצורות סינגלט ומרובים ברביע הימני העליון, עם סינגלטים כענן האירועים הנמוך ביותר ואחריו כפילים ושלישיות בסדר עולה.
פסולת מסומנת על ידי אירועים בשני הרבעים השמאליים ביותר בהכנת גרעינים באיכות נמוכה שבה הושמט שלב פינוי הפסולת. פסולת מהווה יותר מ-40% מהאירועים. עם זאת, בניסוי איכותי, פסולת מהווה פחות מ-15% מכלל האירועים.
חובה להסיר לחלוטין את השכבה האמצעית בעקבות שלב הצנטריפוגה להסרת פסולת כדי להפחית את הרקע המזהם גרעיני RNA שבודדו באמצעות פרוטוקול זה יכולים לשמש לריצוף RNA של גרעין יחיד או לריצוף ATAC כדי לקבל מידע תעתיקומי ואפיגנטי ברמת התא הבודד. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לחקור את ויסות הגנים במוח ברמת התא הבודד בדג הטורקיז האפריקאי, אורגניזם מודל של בעלי חוליות קצרי חיים באופן טבעי לחקר ההזדקנות.
