基于适配体的靶标检测通过 3 级 G-四链体等温指数扩增反应进行

该方法提供了一种将结合事件的信号放大成可目视检测的形式的方法，以实现低资源使用，或者可以使用基于吸光度的仪器进行量化。这是一种相对快速的单罐方案，用于确定目标样品中是否存在适配体靶标。如果需要定量，可以将结果与标准校准曲线进行比较。

个人在转移和混合溶液时必须非常精确，因为混合不充分会导致负面结果。此外，确保试剂和溶液在使用前保持冷藏，以尽量减少背景信号。首先通过在PCR管中加入五个单位的T4多核苷酸激酶来激活核酶切割产物。

然后，向每个样品管中加入一微升预先制备的5X核酶缓冲液。为了直观地展示特异性，向每个样品管中加入 1.5 微升两毫摩尔茶碱或两毫摩尔咖啡因作为测试样品，并通过移液 5 到 10 次彻底混合每个样品。接下来，向每个样品管中加入两微升含有靶标特异性适体结构域的 600 纳摩尔 RNA，然后移液以快速混合组分。

现在，将管子放在冷块上以最小化背景信号。准备好所有反应管后，将每个样品在室温下孵育三分钟。孵育结束时，立即将样品管放回冰中。

向每个样品管中加入3.5微升nicase聚合酶混合物并充分混合。然后，向每个样品管中加入31.5微升含有模板核苷酸和反应缓冲液的EXPAR反应混合物，并通过移液混合。制备完所有样品后，使用计时器将制备的样品在 55 摄氏度下孵育五分钟。

孵育后立即将样品管放回冰中。向每个样品管中加入两微升血红素溶液以进行显色并充分混合。然后，向每个样品管中加入 58 微升市售 TMB 溶液，充分混合，并孵育以进行显色。

如手稿中所述，用肉眼定性读取样品或使用吸光度酶标仪定量结果。优化后的构建体可以在30分钟内识别低至500纳摩尔的茶碱。暴露于靶标的样品制备物产生蓝色，而不含靶标的样品保持无色。

在显色30分钟后，根据在A450处测量的信号制备标准曲线。在不进行孵育时，将样品保存在冰上很重要，因为即使是优化的RNA仍然会表现出较低的背景活性水平。