3段階G四重鎖等温指数増幅反応によるアプタマーベースのターゲット検出(英語)

この方法は、結合イベントからのシグナルを、低資源使用のために視覚的に検出可能な形態に増幅する方法、または吸光度ベースの機器を使用して定量化する方法を提供します。これは、目的のサンプル中のアプタマーのターゲットの存在を判断するための比較的迅速なワンポットプロトコルです。定量が必要な場合は、結果を標準検量線と比較できます。

不十分な混合は否定的な結果につながるので、溶液を移して混合するとき、個人は非常に正確でなければなりません。また、バックグラウンドシグナルを最小限に抑えるために、試薬と溶液が使用するまで冷やされていることを確認してください。まず、PCRチューブに5ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼを加えて、リボザイム切断産物を活性化します。

次に、予め調製した5Xリボザイムバッファー1マイクロリットルを各サンプルチューブに加える。特異性を視覚的に示すには、試験サンプルとして各サンプルチューブに1.5マイクロリットルの2ミリモルテオフィリンまたは2ミリモルカフェインを加え、5〜10回ピペッティングして各サンプルを完全に混合します。次に、標的特異的アプタメアドメインを含む600ナノモルRNAを2マイクロリットルずつ各サンプルチューブに加え、ピペッティングで成分を素早く混合します。

次に、チューブをコールドブロックに配置して、バックグラウンド信号を最小限に抑えます。すべての反応チューブを準備した後、各サンプルを室温で正確に3分間インキュベートします。インキュベーションが終了したら、すぐにサンプルチューブを氷に戻します。

3.5マイクロリットルのニカーゼポリメラーゼ酵素混合物を各サンプルチューブに加え、よく混合します。次いで、鋳型ヌクレオチドと反応緩衝液を含むEXPAR反応混合物31.5マイクロリットルを各サンプル管に加え、ピペッティングにより混合する。すべてのサンプルが準備されたら、タイマーを使用して準備したサンプルを摂氏55度で5分間インキュベートします。

インキュベーション後すぐにサンプルチューブを氷に戻します。発色のために各サンプルチューブに2マイクロリットルのヘミン溶液を加え、よく混ぜます。次に、市販のTMB溶液を各サンプルチューブに58マイクロリットル加え、よく混合し、インキュベートして発色させます。

原稿に記載されているように、目でサンプルを定性的に読み取るか、吸光プレートリーダーを使用して結果を定量化します。最適化された構築物は、30分でわずか500ナノモルのテオフィリンを認識することができました。ターゲットに曝露されたサンプル調製物は青色を生成しますが、ターゲットを含まないサンプルは無色のままです。

30分間の発色後にA450で測定したシグナルから標準曲線を作成した。最適化されたRNAでさえ低いバックグラウンド活性レベルを示すため、インキュベーションを行わないときはサンプルを氷上に保つことが重要です。