Detección de objetivos basada en aptámeros facilitada por una reacción de amplificación exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 etapas

Este método ofrece una forma de amplificar la señal de los eventos de enlace en una forma que es detectable visualmente para un bajo uso de recursos o que se puede cuantificar utilizando instrumentación basada en absorbancia. Este es un protocolo relativamente rápido de un solo recipiente para determinar la presencia del objetivo del aptámero en una muestra de interés. Los resultados se pueden comparar con una curva de calibración estándar si se desea la cuantificación.

Los individuos deben ser muy precisos al transferir y mezclar las soluciones, ya que una mezcla insuficiente conducirá a resultados negativos. Además, asegúrese de que los reactivos y las soluciones se mantengan refrigerados hasta su uso para minimizar la señal de fondo. Comience activando los productos de escisión de ribozima agregando cinco unidades de polinucleótido quinasa T4 en un tubo de PCR.

Luego, agregue un microlitro de tampón de ribozima 5X preparado previamente a cada tubo de muestra. Para demostrar visualmente la especificidad, agregue 1.5 microlitros de dos teofilina milimolar o dos cafeína milimolar a cada tubo de muestra como muestras de prueba y mezcle cada muestra a fondo pipeteando de cinco a 10 veces. A continuación, agregue dos microlitros de 600 ARN nanomolares que contengan un dominio aptámero específico del objetivo a cada tubo de muestra, seguido de un pipeteo para mezclar los componentes rápidamente.

Ahora, coloque el tubo en un bloque frío para minimizar la señal de fondo. Después de preparar todos los tubos de reacción, incubar cada muestra a temperatura ambiente durante exactamente tres minutos. Al final de la incubación, devolver los tubos de muestra al hielo inmediatamente.

Agregue 3.5 microlitros de mezcla de enzima nicasa polimerasa a cada tubo de muestra y mezcle bien. Luego, agregue 31.5 microlitros de mezcla de reacción EXPAR que contenga nucleótidos plantilla y tampón de reacción a cada tubo de muestra y mezcle por pipeteo. Una vez que todas las muestras estén preparadas, incubar la muestra preparada a 55 grados centígrados durante cinco minutos con un temporizador.

Devuelva inmediatamente los tubos de muestra al hielo después de la incubación. Agregue dos microlitros de solución de hemina a cada tubo de muestra para el desarrollo del color y mezcle bien. Luego, agregue 58 microlitros de la solución TMB disponible comercialmente a cada tubo de muestra, mezcle bien e incube para el desarrollo del color.

Lea las muestras cualitativamente a ojo o cuantifique los resultados utilizando un lector de placas de absorbancia, como se describe en el manuscrito. La construcción optimizada podría reconocer tan poco como 500 teofilina nanomolar en 30 minutos. Las preparaciones de muestras expuestas al objetivo producen un color azul, mientras que las muestras que no contienen ningún objetivo permanecen incoloras.

Se preparó una curva estándar a partir de la señal medida en A450 después de 30 minutos de desarrollo del color. Es importante mantener las muestras en hielo cuando no se realizan incubaciones, ya que incluso el ARN optimizado seguirá exhibiendo un bajo nivel de actividad de fondo.