Détection de cible basée sur des aptamères facilitée par une réaction d’amplification exponentielle isotherme G-quadruplex en 3 étapes

Cette méthode offre un moyen d’amplifier le signal des événements de liaison sous une forme détectable visuellement pour une utilisation à faible ressource ou pouvant être quantifiée à l’aide d’une instrumentation basée sur l’absorbance. Il s’agit d’un protocole relativement rapide et unique pour déterminer la présence de la cible de l’aptamère dans un échantillon d’intérêt. Les résultats peuvent être comparés à une courbe d’étalonnage standard si une quantification est souhaitée.

Les individus doivent être très précis lors du transfert et du mélange des solutions, car un mélange insuffisant entraînera des résultats négatifs. Assurez-vous également que les réactifs et les solutions sont conservés au frais jusqu’à leur utilisation afin de minimiser le signal de fond. Commencez par activer les produits de clivage du ribozyme en ajoutant cinq unités de polynucléotide kinase T4 dans un tube de PCR.

Ensuite, ajoutez un microlitre de tampon ribozyme 5X pré-préparé à chaque tube d’échantillon. Pour démontrer visuellement la spécificité, ajoutez 1,5 microlitre de théophylline millimolaire ou deux millimolaires de caféine à chaque tube d’essai comme échantillons d’essai et mélangez soigneusement chaque échantillon en pipetant cinq à 10 fois. Ensuite, ajoutez deux microlitres de 600 nanomolaires d’ARN contenant un domaine aptamique spécifique à la cible à chaque tube d’échantillon, puis un pipetage pour mélanger rapidement les composants.

Maintenant, placez le tube sur un bloc froid pour minimiser le signal de fond. Après avoir préparé tous les tubes de réaction, incuber chaque échantillon à température ambiante pendant exactement trois minutes. À la fin de l’incubation, remettre immédiatement les tubes d’échantillon dans la glace.

Ajouter 3,5 microlitres de mélange enzymatique de polymérase nicase à chaque tube d’échantillon et bien mélanger. Ensuite, ajouter 31,5 microlitres de mélange réactionnel EXPAR contenant des nucléotides matrices et un tampon réactionnel à chaque tube d’échantillon et mélanger par pipetage. Une fois tous les échantillons préparés, incuber l’échantillon préparé à 55 degrés Celsius pendant cinq minutes à l’aide d’une minuterie.

Remettre immédiatement les tubes d’échantillon dans la glace après l’incubation. Ajouter deux microlitres de solution d’hémine à chaque tube d’échantillon pour le développement de la couleur et bien mélanger. Ensuite, ajoutez 58 microlitres de la solution TMB disponible dans le commerce à chaque tube d’échantillon, mélangez bien et incuber pour le développement de la couleur.

Lire les échantillons qualitativement à l’œil nu ou quantifier les résultats à l’aide d’un lecteur de plaque absorbante, comme décrit dans le manuscrit. La construction optimisée pourrait reconnaître aussi peu que 500 nanomolaires théophylline en 30 minutes. Les préparations d’échantillons exposées à la cible produisent une couleur bleue, tandis que les échantillons ne contenant aucune cible restent incolores.

Une courbe standard a été préparée à partir du signal mesuré à A450 après 30 minutes de développement des couleurs. Il est important de garder les échantillons sur la glace lorsque vous n’effectuez pas d’incubations, car même l’ARN optimisé présentera toujours un faible niveau d’activité de fond.