3단계 G-Quadruplex 등온 지수 증폭 반응에 의해 촉진되는 Aptamer 기반 표적 검출

이 방법은 바인딩 이벤트의 신호를 낮은 리소스 사용을 위해 시각적으로 감지할 수 있거나 흡광도 기반 기기를 사용하여 정량화할 수 있는 형태로 증폭하는 방법을 제공합니다. 이것은 관심 샘플에서 압타머 표적의 존재를 결정하기 위한 비교적 빠른 원팟 프로토콜입니다. 정량화가 필요한 경우 결과를 표준 검량선과 비교할 수 있습니다.

개인은 용액을 옮기고 혼합할 때 매우 정확해야 합니다., 불충분한 혼합은 부정적인 결과를 초래할 수 있기 때문입니다. 또한 배경 신호를 최소화하기 위해 사용할 때까지 시약과 용액을 차갑게 유지하십시오. PCR 튜브에 5 유닛의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 첨가하여 리보자임 절단 생성물을 활성화시키는 것으로 시작합니다.

그런 다음 1마이크로리터의 미리 준비된 5X 리보자임 완충액을 각 샘플 튜브에 추가합니다. 특이성을 시각적으로 입증하기 위해 1.5 마이크로리터의 2밀리몰 테오필린 또는 2 밀리몰 카페인을 각 샘플 튜브에 테스트 샘플로 추가하고 5-10회 피펫팅하여 각 샘플을 완전히 혼합합니다. 다음으로, 표적 특이적 앱타머 도메인을 포함하는 600나노몰 RNA 2마이크로리터를 각 샘플 튜브에 추가한 다음 피펫팅하여 구성 요소를 빠르게 혼합합니다.

이제 배경 신호를 최소화하기 위해 튜브를 콜드 블록에 놓습니다. 모든 반응 튜브를 준비한 후 각 샘플을 실온에서 정확히 3분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 샘플 튜브를 즉시 얼음으로 되돌립니다.

3.5마이크로리터의 니카제 중합효소 혼합물을 각 샘플 튜브에 넣고 잘 섞습니다. 그런 다음 주형 뉴클레오티드와 반응 완충액을 포함하는 31.5 마이크로리터의 EXPAR 반응 혼합물을 각 샘플 튜브에 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 모든 샘플이 준비되면 타이머를 사용하여 준비된 샘플을 섭씨 55도에서 5분 동안 배양합니다.

배양 후 즉시 샘플 튜브를 얼음으로 되돌립니다. 발색을 위해 각 샘플 튜브에 2마이크로리터의 헤민 용액을 추가하고 잘 혼합합니다. 그런 다음 시중에서 판매되는 TMB 용액 58마이크로리터를 각 샘플 튜브에 넣고 잘 혼합한 다음 발색을 위해 배양합니다.

샘플을 눈으로 정성적으로 읽거나 원고에 설명된 대로 흡광도 플레이트 리더를 사용하여 결과를 정량화합니다. 최적화된 구조는 30분 안에 500나노몰 테오필린을 인식할 수 있습니다. 표적에 노출된 시료 전처리는 파란색을 띠는 반면, 표적이 없는 시료는 무색으로 남습니다.

30분의 발색 후 A450에서 측정된 신호로부터 표준 곡선을 준비하였다. 인큐베이션을 수행하지 않을 때는 샘플을 얼음 위에 보관하는 것이 중요한데, 최적화된 RNA라도 여전히 낮은 백그라운드 활성 수준을 나타내기 때문입니다.