Этот метод предлагает способ усиления сигнала от событий связывания в форму, которая обнаруживается визуально при низком использовании ресурсов или может быть количественно определена с помощью приборов на основе поглощения. Это относительно быстрый протокол с одним горшком для определения присутствия мишени аптамера в интересующей выборке. Результаты могут быть сопоставлены со стандартной калибровочной кривой, если требуется количественная оценка.
Люди должны быть очень аккуратными при переносе и смешивании растворов, так как недостаточное смешивание приведет к отрицательным результатам. Кроме того, следите за тем, чтобы реагенты и растворы оставались охлажденными до использования, чтобы свести к минимуму фоновый сигнал. Начните с активации продуктов расщепления рибозима путем добавления пяти единиц полинуклеотидкиназы Т4 в пробирку для ПЦР.
Затем добавьте один микролитр предварительно подготовленного 5-кратного буфера рибозима в каждую пробирку для образцов. Чтобы визуально продемонстрировать специфичность, добавьте 1,5 микролитра двухмиллимолярного теофиллина или двух миллимоляров кофеина в каждую пробирку для образца в качестве исследуемых образцов и тщательно перемешайте каждый образец путем пипетки от пяти до 10 раз. Затем добавляют два микролитра 600 наномолярной РНК, содержащей целевой аптамерный домен, в каждую пробирку с образцом, а затем пипетируют для быстрого смешивания компонентов.
Теперь поместите трубку на холодный блок, чтобы свести к минимуму фоновый сигнал. После подготовки всех реакционных пробирок инкубируйте каждый образец при комнатной температуре ровно три минуты. По окончании инкубации немедленно верните пробирки с образцом в лед.
Добавьте 3,5 микролитра ферментной смеси никазполимеразы в каждую пробирку для образца и хорошо перемешайте. Затем добавьте 31,5 микролитра реакционной смеси EXPAR, содержащей матричные нуклеотиды и реакционный буфер, в каждую пробирку для образцов и перемешайте пипеткой. После того, как все образцы будут подготовлены, инкубируйте подготовленный образец при температуре 55 градусов Цельсия в течение пяти минут с помощью таймера.
Сразу же верните пробирки с образцами в лед после инкубации. Добавьте два микролитра раствора гемина в каждую пробирку для образца для проявления цвета и хорошо перемешайте. Затем добавьте 58 микролитров коммерчески доступного раствора TMB в каждую пробирку с образцом, хорошо перемешайте и инкубируйте для проявления цвета.
Качественно считайте образцы на глаз или количественно оцените результаты с помощью считывателя абсорбционных пластин, как описано в рукописи. Оптимизированная конструкция может распознавать всего 500 наномолярных теофиллинов за 30 минут. Препараты образцов, подвергшиеся воздействию мишени, дают синий цвет, в то время как образцы, не содержащие мишени, остаются бесцветными.
Стандартная кривая была подготовлена из сигнала, измеренного на A450 после 30 минут проявления цвета. Важно держать образцы на льду, когда они не проводят инкубацию, так как даже оптимизированная РНК все равно будет демонстрировать низкий уровень фоновой активности.
