疏螺旋体是螺旋体细菌的一个属，包括三种主要种类。莱姆疏螺旋体病组、回归热组以及在爬行动物中发现的特征较差的组。许多疏螺旋体属具有致病性。
细菌培养是检测感染的金标准。研究和临床工作都是如此。体液和组织中的细菌培养证实细菌既有活力又具有复制性。
该协议展示了成功培养和保存莱姆疏螺旋体，回归热疏螺旋体和宫本疏螺旋体组所需的方法和配方。为培养以前分离的物种和菌株以及来自环境或哺乳动物来源的新分离株和单克隆分离株提供了方法。博士后研究员Marie-Line Faucillion和Bergstrom实验室的技术员Ingela Nilsson，劳埃德实验室的研究助理Anne Berthold和Rudenko实验室的研究助理Maryna Golovchenko将展示该程序。
首先，获取制备一升芭芭拉-斯托纳-凯利或BSK-II培养基所需的试剂。首先通过搅拌水将BSA溶解在烧杯中。然后加入所有干化学品，让它们溶解，然后再加入CMRL。
将培养基的pH值调节至7.6。如有必要，使用一摩尔氢氧化钠。接下来，将兔血清添加到培养基中，浓度为6至10%如果细菌生长不强烈，则向培养基中加入另外一种至2%的血清。
然后使用0.22微米孔过滤器对培养基进行灭菌。将培养基的库存冷冻成 100 或 400 毫升等分试样。对于回归热菌株，将 100 毫升 7% 无菌明胶加入 400 毫升 BSK-II 培养基中。
用7%乙醇对表面和所有材料进行消毒，并立即将其转移到生物安全柜中。在工作开始前对所有非生物材料进行紫外线消毒五分钟。要开始培养，请在培养箱中预热培养基。
然后将1毫升甘油原液中的解冻疏螺旋体培养物加入5至15毫升预热的BSK培养基中。在关闭试管之前，几乎完全填充试管以形成微或厌氧气氛。在 37 摄氏度下生长回归热物种，在 33 至 34 摄氏度下生长伯氏疏螺旋体。
使用相衬或暗场显微镜以200至400倍放大倍率监测疏螺旋体培养物的生长。为确保细胞均匀分布，将培养物与血清移液器混合或使用三毫升移液管，同时上下移液。然后在血细胞计数器的每一侧加载到10微升培养等分试样进行计数。
接下来，用1.7毫升管中的培养基以1比2或1比4的比例稀释指数期疏螺旋体培养物。确定细胞计数时，请适当考虑稀释因子。使用后，用10%稀释的漂白剂和/或70%乙醇喷洒表面和血细胞计数器。
为了提取DNA或分离疏螺旋体细胞，将指数相培养物以4， 000 G离心10分钟，并将上清液丢弃在合适的生物危害废物中。使用商业DNA提取试剂盒处理沉淀的细菌，或将其重悬于适当的培养基中进行预期的实验。在每个实验结束时，用乙醇和紫外线辐射对所有设备进行消毒。
将液体废物（包括多余的培养物）收集在废瓶中，并加入10%的漂白剂。将瓶子放在 80 摄氏度下，然后再丢弃。对于伯氏疏螺旋体培养物的长期储存，取所需体积的指数相培养物，每毫升1000万至1亿个细胞，加入10%无菌甘油，并通过上下移液混合。
将1.5毫升等分试样的混合物转移到两毫升螺旋盖低温小瓶中。将库存小瓶存放在 80 摄氏度。在冰箱中保持每种菌株至少 10 管的库存，要从硬蜱中培养疏螺旋体，请收集成年雌性、雄性和若虫蜱。
通过将蜱虫浸入 70% 乙醇中两分钟并在生物安全柜中风干来对蜱虫进行表面消毒。接下来，使用无菌手术刀将蜱虫单独解剖成几块。然后将碎片放入含有1.5毫升补充抗生素的培养基的两毫升管中。
在 34 摄氏度下孵育培养物，并通过暗场或相差显微镜检查螺旋体，前两周每周两次，之后每周检查一次，持续六周。要从血液样本中培养疏螺旋体，请轻轻地从管中取出血浆，并将一毫升血浆接种到五毫升预热的改良凯利-佩滕科弗或MKP完全培养基中。对于从皮肤活检培养疏螺旋体，用70%乙醇和过氧化氢对皮肤活检进行表面灭菌。
然后将活检样本置于生理盐水中。在玻璃培养皿中浸入生理盐水中，使用无菌剃须刀片将样品切成两到六个较小的块。将切成丁的样品和储存皮肤活检的一毫升盐水转移到五毫升补充有抗生素的预热培养基中，并在33摄氏度下孵育。
制作盘子时，加热 300 毫升不含明胶的 1.5x BSK 或 MKP 完全培养基。同时将 200 毫升 1.7% 琼脂糖加热至 55 摄氏度。将液体混合，将每个 15 毫升移液到 16 个深培养皿中，以制作底部琼脂层。
将培养基的其余部分保持在水浴中。定量疏螺旋体培养密度并在液体培养基中稀释至所需密度。底板凝固后，将10毫升剩余的琼脂混合物作为顶部琼脂加入含有适当数量的螺旋体的15毫升管中。
将悬浮液倒入底部琼脂平板上，放入标记的培养皿中。板凝固后，关闭它们并将它们倒置在 34 至 35 摄氏度的 2.5% 二氧化碳中。正确制备后，BSK培养基呈红橙色和透明。
为了进行比较，此处还显示了MKP未接种培养基。竞争细菌的过度生长会在培养基中产生浑浊和结块的物质。通过相差或暗场显微镜目视检查监测细菌生长。
在指数阶段，疏螺旋体细胞通常细长、扭结和在某种程度上是模态的。随着培养物在固定相处进入，圆体越来越明显。疏螺旋体细胞是挑剔的，每个物种和菌株甚至分离物在遗传上和通过适应它们被分离的宿主而有所不同。
在制作培养基时，适当的成分对疏螺旋体培养的活力甚至培养的生存能力产生巨大影响。螺旋疏螺旋体对培养具有挑战性，但培养是可能的。实验室中的培养是研究这些细菌生物学的跳板。
培养为了解疏螺旋体物种的基因组、蛋白质组、进化和宿主病原体相互作用提供了材料。疏螺旋体培养可能需要数周时间才能使螺旋体足够丰度以进行检测。这限制了诊断应用程序。
但培养可以显示疏螺旋体物种是否存在、存活和复制，并且可以帮助获得治疗。
