Borrelia, üç ana türü kapsayan bir spiroket bakteri cinsidir. Lyme Borreliosis grubu, Relapsing Fever grubu ve sürüngenlerde bulunan daha az iyi karakterize edilmiş grup. Birçok Borrelia türü patojeniktir.
Bakteri kültürü, enfeksiyonun tespiti için altın standarttır. Bu hem araştırma hem de klinik çalışmalar için geçerlidir. Vücut sıvısından ve dokularından alınan bakteri kültürü, bakterilerin hem canlı hem de çoğaldığını doğrular.
Bu protokol, Lyme Borreliosis spiroket grubunu, Relapsing Fever Borrelia ve Borrelia miyamotoi'yi başarılı bir şekilde kültürlemek ve korumak için gereken metodolojiyi ve tarifleri göstermektedir. Daha önce izole edilmiş türlerin ve suşların yanı sıra çevresel veya memeli kaynaklarından yeni izolatlar ve monoklonal izolatların kültürü için yöntemler sağlanmıştır. Prosedürü gösteren, doktora sonrası araştırmacı Marie-Line Faucillion ve Bergstrom Laboratuvarı'ndan teknisyen Ingela Nilsson, Lloyd Laboratuvarı'ndan araştırma görevlisi Anne Berthold ve Rudenko Laboratuvarı'ndan araştırma görevlisi Maryna Golovchenko olacak.
Başlamak için, bir litre Barbara-Stoner-Kelly veya BSK-II ortamı hazırlamak için gereken reaktifleri edinin. BSA'yı suyu karıştırarak bir beherde çözerek başlayın. Daha sonra tüm kuru kimyasalları ekleyin ve CMRL eklemeden önce çözünmelerini bekleyin.
Ortamın pH'ını 7.6'ya ayarlayın. Gerekirse, bir molar sodyum hidroksit kullanın. Daha sonra, ortama% altı ila% 10'luk bir konsantrasyona tavşan serumu ekleyinBakteriyel büyüme güçlü değilse, ortama bir tane daha% 2 serum ekleyin.
Daha sonra ortamı 0.22 mikron gözenekli bir filtre kullanarak sterilize edin. Ortamın stokunu 100 veya 400 mililitre alikotta dondurun. Relapsing Fever suşları için, 400 mililitre BSK-II ortamına 100 mililitre% 7 steril jelatin ekleyin.
Yüzeyi ve tüm malzemeleri %7 etanol ile dezenfekte edin ve derhal biyolojik güvenlik kabinine aktarın. UV, biyolojik olmayan tüm malzemeleri çalışmaya başlamadan önce beş dakika boyunca sterilize eder. Bir kültürü başlatmak için, ortamı bir inkübatörde önceden ısıtın.
Daha sonra bir gliserol stoğundan beş ila 15 mililitre önceden ısıtılmış BSK ortamına bir mililitre çözülmüş Borrelia kültürü ekleyin. Kapatmadan önce mikro veya anaerobik bir atmosfer oluşturmak için tüpleri neredeyse tamamen doldurun. 37 santigrat derecede Relapsing Fever türlerini ve 33 ila 34 santigrat derecede Borrelia burgdorferi sensu lato türlerini yetiştirin.
Borrelia kültürünün büyümesini, faz kontrastı veya karanlık alan mikroskobu kullanarak 200 ila 400 kat büyütmede izleyin. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için kültürü serolojik bir pipetle karıştırın veya yukarı ve aşağı pipetleme yaparken üç mililitrelik bir transfer pipeti kullanın. Daha sonra sayım için bir hemositometrenin her iki tarafındaki 10 mikrolitre kültür aliquot'a yükleyin.
Daha sonra, üstel faz Borrelia kültürünü bire iki veya bire dört oranında 1.7 mililitrelik bir tüpte bir ortamla seyreltin. Hücre sayısını belirlerken, seyreltme faktörünü uygun şekilde göz önünde bulundurun. Kullandıktan sonra, yüzeylere ve hemositometreye% 10 seyreltilmiş ağartıcı ve/veya %70 etanol püskürtün.
DNA'nın ekstraksiyonu veya Borrelia hücrelerinin izolasyonu için, üstel faz kültürünü 4.000 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı uygun bir biyolojik tehlike atığına atın. Peletlenmiş bakterileri ticari bir DNA ekstraksiyon kiti ile işleyin veya amaçlanan deney için uygun bir ortamda askıya alın. Her deneyin sonunda, tüm ekipmanı etanol ve UV radyasyonu ile sterilize edin.
Fazla kültür de dahil olmak üzere sıvı atıkları bir atık şişesinde toplayın ve% 10 çamaşır suyu ekleyin. Şişeyi atmadan önce 80 santigrat dereceye yerleştirin. Borrelia kültürlerinin uzun süreli depolanması için, mililitre başına 10 milyon ila 100 milyon hücrede üstel faz kültürünün istenen hacmini alın,% 10 steril gliserol ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
Karışımın 1.5 mililitre alikotunu iki mililitre vidalı kapaklı kriyojenik şişelere aktarın. Stok şişelerini 80 santigrat derecede saklayın. Dondurucudaki her suşun en az 10 tüpü olan bir stoğu koruyun, Borrelia'yı sert kenelerden yetiştirmek için yetişkin dişileri, erkekleri ve nimf kenelerini toplayın.
Yüzey sterilize ederek keneleri iki dakika boyunca% 70 etanol içine batırın ve bir biyogüvenlik kabininde hava ile kurutun. Daha sonra, steril bir neşter kullanarak keneleri ayrı ayrı birkaç parçaya ayırın. Daha sonra parçaları, antibiyotiklerle desteklenmiş 1.5 mililitre ortam içeren iki mililitrelik tüpe yerleştirin.
Kültürleri 34 santigrat derecede inkübe edin ve ilk iki hafta boyunca haftada iki kez karanlık alan veya faz kontrast mikroskobu ile spiroketleri kontrol edin ve bundan sonra altı hafta boyunca haftada bir kontrol edin. Borrelia'yı kan örneklerinden yetiştirmek için, plazmayı tüpten yavaşça çıkarın ve bir mililitre plazmayı beş mililitre önceden ısıtılmış, Modifiye Kelly-Pettenkofer veya MKP Tam ortama aşılayın. Borrelia'nın cilt biyopsisinden yetiştirilmesi için, yüzey cilt biyopsisini% 70 etanol ve hidrojen peroksit ile sterilize eder.
Daha sonra biyopsi örneğini fizyolojik salin içine yerleştirin. Fizyolojik saline batırılmışken cam Petri kabında steril bir tıraş bıçağı kullanarak numuneyi iki ila altı küçük parçaya bölün. Doğranmış numuneyi ve cilt biyopsisinin depolandığı bir mililitre salini, antibiyotiklerle desteklenmiş beş mililitre önceden ısıtılmış ortama aktarın ve 33 santigrat derecede inkübe edin.
Plaka yapmak için, sıcak 300 mililitre 1.5x BSK veya MKP Jelatinsiz komple ortam. Ayrıca ılık 200 mililitre% 1.7 agarose 55 santigrat dereceye yükseldi. Alt agar tabakasını oluşturmak için sıvıları ve pipeti her biri 15 mililitre olan 16 derin Petri kabına karıştırın.
Ortamın geri kalanını bir su banyosunda tutun. Borrelia kültür yoğunluğunu ölçün ve sıvı bir ortamda istenen yoğunluğa seyreltin. Alt plakalar katılaştıktan sonra, kalan agar karışımının 10 mililitresini, uygun sayıda spiroket içeren 15 mililitrelik bir tüpe üst agar olarak ekleyin.
Süspansiyonu alt agar plakasına etiketli Petri kabına dökün. Plakalar katılaştıktan sonra, onları kapatın ve% 2.5 karbondioksit içinde 34 ila 35 santigrat derecede baş aşağı yerleştirin. Doğru hazırlandığında, BSK ortamı kırmızı-turuncu ve net görünüyordu.
Karşılaştırma için, MKP aşılanmamış ortam da burada gösterilmiştir. Rakip bakteriler tarafından aşırı çoğalma, ortamda bulanıklık ve kümelenmiş malzemeler oluşturur. Bakteriyel büyüme, faz kontrastı veya karanlık alan mikroskobu ile görsel inceleme ile izlendi.
Üstel fazda, Borrelia hücreleri tipik olarak ince, bükülmüş ve bir dereceye kadar modaldır. Kültürler durağan faza girdikçe, yuvarlak cisimler giderek daha belirgin hale gelir. Borrelia hücreleri titizdir ve her tür ve suş ve hatta izolat, hem genetik olarak hem de izole edildikleri konakçıya adaptasyon yoluyla farklılık gösterir.
Medya yaparken, uygun malzemeler Borrelia kültürünün canlılığında ve hatta kültürün yaşayabilirliğinde büyük bir fark yaratır. Borrelia spiroketleri kültüre meydan okur, ancak kültür mümkündür. Laboratuvardaki kültür, bu bakterilerin biyolojisi üzerine araştırmalar için sıçrama tahtasıdır.
Kültür, Borrelia türlerinin genomunu, proteomunu, evrimini ve konakçı patojen etkileşimlerini anlamak için materyal sağlar. Borrelia kültürü, spiroketlerin tespit için yeterince bol olması birkaç hafta sürebilir. Bu, tanılama uygulamalarını sınırlar.
Ancak kültür, Borrelia türlerinin mevcut, canlı ve çoğalan olup olmadığını gösterebilir ve tedavilere erişmeye yardımcı olabilir.
