ボレリアは、3つの主要な種類を含むスピロヘータ細菌の属です。ライムボレリア症グループ、再発熱グループ、および爬虫類に見られるあまり特徴のないグループ。多くのボレリア種は病原性です。
細菌の培養は感染を検出するためのゴールドスタンダードです。これは、研究と臨床研究の両方に当てはまります。体液および組織からの細菌の培養は、細菌が生存可能であり、複製可能であることを確認する。
このプロトコルは、ライムボレリア症グループのスピロヘータ、再発発熱ボレリア、およびボレリアミヤモトイの培養と保存を成功させるために必要な方法論とレシピを示しています。以前に単離された種および株、ならびに環境または哺乳類の供給源からの新しい分離株およびモノクローナル単離物の培養のための方法が提供される。手順を実演するのは、ポスドク研究員のマリーラインフォーシリオン、バーグストロム研究所の技術者であるインゲラニルソン、ロイド研究所の研究員であるアンベルトルド、ルデンコ研究所の研究員であるマリナゴロフチェンコです。
まず、1リットルのバーバラ・ストーナー・ケリー培地またはBSK-II培地を調製するために必要な試薬を入手します。水をかき混ぜてBSAをビーカーに溶かすことから始めます。次に、すべての乾燥化学物質を追加し、CMRLを追加する前にそれらを溶解させます。
培地のpHを7.6に調整します。必要に応じて、1モルの水酸化ナトリウムを使用してください。次に、ウサギ血清を培地に6〜10%の濃度で加えます細菌の増殖が強くない場合は、さらに2%血清を培地に追加します。
次に、0.22ミクロンのポアフィルターを使用して培地を滅菌します。培地のストックを100または400ミリリットルのアリコートで凍結します。再発熱株の場合は、100ミリリットルの7%滅菌ゼラチンを400ミリリットルのBSK-II培地に加えます。
表面とすべての材料を7%エタノールで消毒し、すぐに生物学的安全キャビネットに移します。作業開始前の5分間、すべての非生物学的材料をUV滅菌します。培養を開始するには、インキュベーター内で培地を予熱します。
次に、グリセロールストックから1ミリリットルの解凍ボレリア培養物を5〜15ミリリットルの予熱したBSK培地に加えます。チューブを閉じる前に、チューブをほぼ完全に満たして、微または嫌気性雰囲気を作ります。摂氏37度で再発熱種を、摂氏33〜34度でボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト種を育てます。
位相差顕微鏡または暗視野顕微鏡を使用して、200〜400倍の倍率でボレリア培養の成長を監視します。細胞の均一な分布を確保するには、培養液を血清学的ピペットと混合するか、3ミリリットルのトランスファーピペットを使用して上下にピペッティングします。次に、カウントのために血球計算盤の両側に10マイクロリットルの培養アリコートをロードします。
次に、指数相ボレリア培養物を1.7ミリリットルチューブ中の培地で1対2または1対4の比率で希釈する。細胞数を決定する際には、希釈係数を適切に考慮してください。使用後は、表面と血球計算盤に10%希釈漂白剤および/または70%エタノールをスプレーします。
DNAの抽出またはボレリア細胞の単離のために、指数相培養を4, 000Gで10分間遠心分離し、適切なバイオハザード廃棄物に上清を廃棄する。ペレット化した細菌を市販のDNA抽出キットで処理するか、目的の実験に適した培地に再懸濁します。各実験の最後に、すべての機器をエタノールと紫外線で滅菌します。
余分な培養液を含む廃液を廃液ボトルに集め、10%漂白剤を加えます。ボトルを摂氏80度に置いてから廃棄してください。ボレリア培養物を長期保存する場合は、ミリリットルあたり1,000万〜1億細胞で指数相培養の希望量を採取し、10%滅菌グリセロールを添加し、上下にピペッティングして混合します。
混合物の1.5ミリリットルアリコートを2ミリリットルのスクリューキャップ極低温バイアルに移します。ストックバイアルは摂氏80度で保管してください。冷凍庫に各株の少なくとも10本のチューブで在庫を維持し、硬いダニからボレリアを栽培するには、成体の雌、雄、および幼虫のダニを収集します。
ダニを70%エタノールに2分間浸して表面滅菌し、バイオセーフティキャビネットで風乾します。次に、滅菌メスを使用してダニを個別にいくつかの部分に解剖します。次に、抗生物質を添加した1.5ミリリットルの培地を含む2ミリリットルのチューブに小片を入れます。
培養液を摂氏34度でインキュベートし、暗視野顕微鏡または位相差顕微鏡でスピロヘータを最初の2週間は週に2回、その後は6週間毎週確認します。血液サンプルからボレリアを培養するには、チューブから血漿を静かに取り出し、1ミリリットルの血漿を5ミリリットルの予熱された変性ケリーペッテンコーファーまたはMKP完全培地に接種します。皮膚生検からのボレリアの培養のために、70%エタノールおよび過酸化水素で皮膚生検を表面滅菌する。
次に、生検サンプルを生理食塩水に入れます。生理食塩水に浸しながら、ガラスシャーレに滅菌かみそりの刃を使用してサンプルを2〜6個の小さな断片にさいの目に切る。さいの目に切ったサンプルと皮膚生検を保存した1ミリリットルの生理食塩水を、抗生物質を添加した5ミリリットルの予熱培地に移し、摂氏33度でインキュベートします。
プレートを作るには、ゼラチンを含まない300ミリリットルの1.5x BSKまたはMKP完全培地を温めます。また、200ミリリットルの1.7%アガロースを摂氏55度に温めます。液体とピペットをそれぞれ15ミリリットルずつ16枚の深いペトリ皿に混ぜて、底寒天層を作ります。
残りの培地を水浴に維持する。ボレリア培養密度を定量化し、液体培地中で所望の密度に希釈します。底板が固まったら、残りの寒天混合物を上寒天として10ミリリットル、適当な数のスピロヘータを入れた15ミリリットルのチューブに加える。
懸濁液を底寒天プレートにラベルを付けたペトリ皿に注ぎます。プレートが固まったら閉じて、34%二酸化炭素に摂氏35〜2.5度で逆さまに置きます。正しく調製すると、BSK培地は赤橙色で透明に見えました。
比較のため、MKP未接種培地もここに示されている。競合する細菌による異常増殖は、培地中に濁りと凝集した物質を生成します。細菌の増殖は、位相差顕微鏡または暗視野顕微鏡による目視検査によってモニターした。
指数関数的段階では、ボレリア細胞は通常、細く、ねじれており、ある程度モーダルです。培養物が静止期に入るにつれて、丸い体はますます明白になります。ボレリア細胞は潔癖であり、それぞれの種および株および単離物でさえ、遺伝的にも、それらが単離された宿主への適応によっても異なる。
培地を作るとき、適切な成分はボレリア文化の活力、あるいは文化の実行可能性さえも大きな違いをもたらします。ボレリア・スピロヘータは培養に挑戦的ですが、培養は可能です。実験室での培養は、これらの細菌の生物学に関する研究の出発点です。
培養は、ボレリア種のゲノム、プロテオーム、進化、および宿主病原体の相互作用を理解するための材料を提供します。ボレリア培養は、スピロヘータが検出のために十分に豊富になるまでに数週間かかることがあります。これにより、診断アプリケーションが制限されます。
しかし、文化はボレリア種が存在し、生存し、複製されているかどうかを示すことができ、治療にアクセスするのに役立ちます。
