Borrelia هو جنس من البكتيريا spirochete التي تشمل ثلاثة أنواع رئيسية. مجموعة لايم بوريليوسيس ، ومجموعة الحمى الانتكاسية ، والمجموعة الأقل تميزا الموجودة في الزواحف. العديد من أنواع بوريليا مسببة للأمراض.
ثقافة البكتيريا هي المعيار الذهبي للكشف عن العدوى. هذا صحيح لكل من البحث والعمل السريري. تؤكد زراعة البكتيريا من سوائل الجسم والأنسجة أن البكتيريا قابلة للحياة وتتكاثر.
يوضح هذا البروتوكول المنهجية والوصفات المطلوبة للنجاح في استزراع والحفاظ على مجموعة Lyme Borreliosis من اللولبيات ، وحمى الانتكاس Borrelia ، و Borrelia miyamotoi. يتم توفير طرق لاستزراع الأنواع والسلالات المعزولة سابقا ، وكذلك العزلات الجديدة والعزلات وحيدة النسيلة من المصادر البيئية أو الثدييات. وستقوم بتوضيح الإجراء ماري لاين فوسيليون ، باحثة ما بعد الدكتوراه ، وإنجيلا نيلسون ، فنية من مختبر بيرجستروم ، وآن بيرتهولد ، باحثة مشاركة من مختبر لويد ، ومارينا جولوفتشينكو ، باحثة مشاركة من مختبر رودينكو.
للبدء ، احصل على الكواشف المطلوبة لإعداد لتر واحد من Barbara-Stoner-Kelly ، أو BSK-II المتوسطة. ابدأ بإذابة BSA في دورق عن طريق تحريك الماء. ثم أضف جميع المواد الكيميائية الجافة واتركها تذوب قبل إضافة CMRL.
اضبط الرقم الهيدروجيني للوسط على 7.6. إذا لزم الأمر ، استخدم هيدروكسيد الصوديوم المولي. بعد ذلك ، أضف مصل الأرنب إلى الوسط بتركيز من ستة إلى 10٪إذا لم يكن النمو البكتيري قويا ، أضف مصلا آخر إلى 2٪ مصل إلى الوسط.
ثم تعقيم الوسط باستخدام مرشح المسام 0.22 ميكرون. تجميد مخزون المتوسطة في 100 أو 400 ملليلتر من القسامة. لسلالات الحمى الانتكاسية ، أضف 100 ملليلتر من الجيلاتين المعقم بنسبة 7٪ إلى 400 ملليلتر من وسط BSK-II.
تطهير السطح وجميع المواد مع 7 ٪ من الإيثانول ونقلها على الفور إلى خزانة السلامة البيولوجية. تعقيم جميع المواد غير البيولوجية بالأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق قبل بدء العمل. لبدء ثقافة ، قم بتسخين الوسيط مسبقا في حاضنة.
ثم أضف ملليلتر واحد من ثقافة بوريليا المذابة من مخزون الجلسرين إلى خمسة إلى 15 ملليلتر من وسط BSK المسخن مسبقا. املأ الأنابيب بالكامل تقريبا لعمل جو دقيق أو لاهوائي قبل إغلاقها. تنمو أنواع الحمى الانتكاسية عند 37 درجة مئوية وأنواع Borrelia burgdorferi sensu lato عند 33 إلى 34 درجة مئوية.
راقب نمو ثقافة بوريليا باستخدام تباين الطور أو الفحص المجهري للمجال المظلم بتكبير 200 إلى 400 مرة. لضمان التوزيع المتساوي للخلايا ، امزج المزرعة مع ماصة مصلية أو استخدم ماصة نقل ثلاثة ملليلتر أثناء السحب لأعلى ولأسفل. ثم قم بتحميل إلى حصص ثقافة 10 ميكرولتر على كل جانب من مقياس الدم للعد.
بعد ذلك ، قم بتخفيف ثقافة Borrelia في المرحلة الأسية بنسبة واحد إلى اثنين أو واحد إلى أربعة مع وسيط في أنبوب 1.7 ملليلتر. عند تحديد عدد الخلايا ، ضع في اعتبارك عامل التخفيف بشكل مناسب. بعد الاستخدام ، قم برش الأسطح ومقياس الدم باستخدام مبيض مخفف بنسبة 10٪ و / أو 70٪ إيثانول.
لاستخراج الحمض النووي أو عزل خلايا بوريليا ، قم بالطرد المركزي لثقافة الطور الأسي لمدة 10 دقائق عند 4،000 جم وتخلص من المادة الطافية في نفايات بيولوجية مناسبة. قم بمعالجة البكتيريا الحبيبية باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية أو أعد تعليقها في وسط مناسب للتجربة المقصودة. في نهاية كل تجربة ، قم بتعقيم جميع المعدات بالإيثانول والأشعة فوق البنفسجية.
اجمع النفايات السائلة ، بما في ذلك الثقافة الزائدة ، في زجاجة نفايات وأضف 10٪ مبيض. ضع الزجاجة على حرارة 80 درجة مئوية قبل التخلص منها. للتخزين طويل الأجل لمزارع بوريليا ، خذ الحجم المطلوب من ثقافة الطور الأسي عند 10 ملايين إلى 100 مليون خلية لكل ملليلتر ، وأضف 10٪ من الجلسرين المعقم ، واخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
نقل 1.5 ملليلتر من القسمة من الخليط إلى اثنين من قوارير المبردة غطاء المسمار ملليلتر. قم بتخزين قوارير المرق على حرارة 80 درجة مئوية. الحفاظ على مخزون مع ما لا يقل عن 10 أنابيب من كل سلالة في الثلاجة ، لزراعة بوريليا من القراد الصلب ، وجمع الإناث البالغات والذكور والقراد الحوريات.
سطح تعقيم القراد عن طريق غمسها في 70 ٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين والهواء الجاف في خزانة السلامة الحيوية. بعد ذلك ، قم بتشريح القراد بشكل فردي إلى عدة قطع باستخدام مشرط معقم. ثم ضع القطع في أنبوبين ملليلتر يحتويان على 1.5 ملليلتر من الوسط المكمل بالمضادات الحيوية.
احتضان الثقافات عند 34 درجة مئوية وتحقق من اللولبيات بواسطة المجهر المظلم أو تباين الطور مرتين أسبوعيا خلال الأسبوعين الأولين وأسبوعيا بعد ذلك لمدة ستة أسابيع. لزراعة Borrelia من عينات الدم ، قم بإزالة البلازما برفق من الأنبوب وتلقيح ملليلتر واحد من البلازما إلى خمسة ملليلتر من وسط Kelly-Pettenkofer أو MKP Complete المسخن مسبقا. لزراعة بوريليا من خزعة الجلد ، تعقيم السطح خزعة الجلد مع 70 ٪ من الإيثانول وبيروكسيد الهيدروجين.
ثم ضع عينة الخزعة في محلول ملحي فسيولوجي. قم بتقطيع العينة إلى قطعتين إلى ست قطع أصغر باستخدام شفرة حلاقة معقمة في طبق زجاجي بتري أثناء غمرها في محلول ملحي فسيولوجي. انقل العينة المقطعة إلى مكعبات ومليلتر واحد من المحلول الملحي الذي تم فيه تخزين خزعة الجلد إلى خمسة ملليلتر من الوسط المسخن مسبقا المكمل بالمضادات الحيوية ، واحتضانه عند 33 درجة مئوية.
لصنع الألواح ، قم بتسخين 300 ملليلتر من 1.5x BSK أو MKP وسط كامل بدون جيلاتين. دافئ أيضا 200 ملليلتر من 1.7 ٪ agarose إلى 55 درجة مئوية. امزج السوائل والماصة 15 ملليلتر لكل منهما على 16 طبقا بتري عميقا لعمل طبقة أجار السفلية.
الحفاظ على بقية الوسط في حمام مائي. تحديد كثافة ثقافة Borrelia وتخفيفها إلى الكثافة المطلوبة في وسط سائل. بعد أن تتجمد الصفائح السفلية ، أضف 10 ملليلترات من خليط الآجار المتبقي في صورة أجار علوي إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا يحتوي على العدد المناسب من اللولبيات.
صب التعليق على لوحة أجار القاع في طبق بتري المصنف. بعد تصلب الألواح ، أغلقها وضعها رأسا على عقب عند 34 إلى 35 درجة مئوية في 2.5٪ ثاني أكسيد الكربون. عند تحضيره بشكل صحيح ، ظهر وسيط BSK باللون الأحمر البرتقالي والواضح.
للمقارنة ، يتم عرض وسيط MKP غير الملقح هنا أيضا. النمو الزائد من قبل البكتيريا المتنافسة يولد التعكر والمواد المتكتلة في الوسط. تمت مراقبة نمو البكتيريا عن طريق الفحص البصري عن طريق تباين الطور أو الفحص المجهري للمجال المظلم.
في المرحلة الأسية ، عادة ما تكون خلايا Borrelia نحيلة وملتوية ومشروطة إلى حد ما. مع دخول الثقافات في المرحلة الثابتة ، أصبحت الأجسام المستديرة واضحة بشكل متزايد. خلايا بوريليا شديدة الحساسية وكل نوع وسلالة وحتى عزل يختلف وراثيا ومن خلال التكيف مع المضيف الذي تم عزله منه.
عند صنع الوسائط ، تحدث المكونات المناسبة فرقا هائلا في قوة ثقافة Borrelia أو حتى جدوى الثقافة. تشكل اللولبيات بوريليا تحديا للثقافة ، لكن الثقافة ممكنة. الثقافة في المختبر هي نقطة انطلاق للبحث في بيولوجيا هذه البكتيريا.
توفر الثقافة المادة اللازمة لفهم الجينوم والبروتين والتطور والتفاعلات الممرضة المضيفة لأنواع بوريليا. يمكن أن تستغرق ثقافة Borrelia عدة أسابيع قبل أن تكون اللولبيات وفيرة بما يكفي للكشف. هذا يحد من تطبيقات التشخيص.
لكن الثقافة يمكن أن تظهر ما إذا كانت أنواع بوريليا موجودة وقابلة للحياة وقابلة للتكرار ، ويمكن أن تساعد في الوصول إلى العلاجات.
