Borrelia는 세 가지 주요 종류를 포함하는 스피로헤타 박테리아의 속입니다. 라임 보렐리오스 그룹, 재발열 그룹, 파충류에서 발견되는 덜 잘 특성화된 그룹. 많은 Borrelia 종은 병원성입니다.
박테리아 배양은 감염 검출을 위한 황금 표준입니다. 이것은 연구와 임상 작업 모두에 해당됩니다. 체액과 조직에서 박테리아를 배양하면 박테리아가 생존 가능하고 복제할 수 있음을 확인할 수 있습니다.
이 프로토콜은 스피로헤타, 재발 발열 보렐리아 및 보렐리아 미야모토이의 라임 보렐리오스 그룹을 성공적으로 배양하고 보존하는 데 필요한 방법론과 레시피를 보여줍니다. 이전에 분리된 종 및 균주의 배양뿐만 아니라 환경 또는 포유류 공급원으로부터 새로운 분리주 및 단클론 분리물을 위한 방법이 제공됩니다. 이 절차를 시연하는 것은 박사후 연구원 인 Marie-Line Faucillion과 Bergstrom Lab의 기술자 인 Ingela Nilsson, Lloyd Lab의 연구원 인 Anne Berthold, Rudenko Lab의 연구원 인 Maryna Golovchenko입니다.
시작하려면 1리터의 Barbara-Stoner-Kelly 또는 BSK-II 배지를 준비하는 데 필요한 시약을 구하십시오. 물을 저어 비커에 BSA를 녹이는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 모든 건조 화학 물질을 첨가하고 CMRL을 첨가하기 전에 용해시킵니다.
배지의 pH를 7.6으로 조정합니다. 필요한 경우 1 몰 수산화 나트륨을 사용하십시오. 다음으로, 6-10%의 농도로 배지에 토끼 혈청을 첨가합니다.박테리아 성장이 강하지 않은 경우 배지에 2% 혈청에 다른 하나를 추가합니다.
그런 다음 0.22 미크론 기공 필터를 사용하여 배지를 멸균합니다. 100 또는 400 밀리리터 부분 표본으로 배지의 주식을 동결하십시오. 재발 열 균주의 경우 100 밀리리터의 7 % 멸균 젤라틴을 BSK-II 배지 400 밀리리터에 첨가하십시오.
표면과 모든 물질을 7 % 에탄올로 소독하고 즉시 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. UV는 작업 시작 전에 5 분 동안 모든 비 생물학적 물질을 살균합니다. 배양을 시작하려면 인큐베이터에서 배지를 예열하십시오.
그런 다음 글리세롤 스톡에서 해동 된 Borrelia 배양 물 1 밀리리터를 예열 된 BSK 배지 5-15 밀리리터에 첨가하십시오. 튜브를 닫기 전에 미세 또는 혐기성 분위기를 만들기 위해 튜브를 거의 완전히 채우십시오. 섭씨 37도에서 재발 발열 종을, 섭씨 33도에서 34도에서 Borrelia burgdorferi sensu lato 종을 재배하십시오.
200-400배 배율의 위상차 또는 암시야 현미경을 사용하여 Borrelia 배양액의 성장을 모니터링합니다. 세포의 균일한 분포를 보장하려면 배양물을 혈청학적 피펫과 혼합하거나 위아래로 피펫팅하면서 3밀리리터 이송 피펫을 사용하십시오. 그런 다음 계수를 위해 혈구계의 양쪽에 10마이크로리터 배양 분취량을 로드합니다.
다음으로, 지수 단계 Borrelia 배양을 1.7 밀리리터 튜브의 배지로 1 대 2 또는 1 대 4의 비율로 희석합니다. 세포 수를 결정할 때 희석 계수를 적절하게 고려하십시오. 사용 후에는 표면과 혈구계에 10% 희석된 표백제 및/또는 70% 에탄올을 뿌립니다.
DNA의 추출 또는 Borrelia 세포의 분리를 위해, 4, 000 G에서 10 분 동안 지수 상 배양을 원심 분리하고 적절한 생물학적 위험 폐기물에 상청액을 버린다. 펠렛화된 박테리아를 상업용 DNA 추출 키트로 처리하거나 의도한 실험을 위해 적절한 배지에 재현탁합니다. 각 실험이 끝나면 모든 장비를 에탄올과 자외선으로 멸균하십시오.
과잉 배양액을 포함한 액체 폐기물을 쓰레기통에 수거하고 표백제를 10% 첨가합니다. 병을 버리기 전에 섭씨 80도에 두십시오. Borrelia 배양의 장기 보관을 위해 원하는 부피의 지수 단계 배양을 밀리리터당 1,000만에서 1억 개의 세포로 취하고 10% 멸균 글리세롤을 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
혼합물의 1.5 밀리리터 분취량을 2 밀리리터 스크류 캡 극저온 바이알에 옮긴다. 스톡 바이알을 섭씨 80도에서 보관하십시오. 냉동실에 각 균주의 튜브를 10 개 이상 보관하고, 딱딱한 진드기에서 Borrelia를 재배하려면 성인 여성, 남성 및 nymphal 진드기를 수집하십시오.
진드기를 70 % 에탄올에 2 분 동안 담그고 생물 안전 캐비닛에서 자연 건조하여 표면을 살균합니다. 다음으로, 멸균 메스를 사용하여 진드기를 개별적으로 여러 조각으로 해부하십시오. 그런 다음 항생제가 보충 된 1.5 밀리리터의 배지가 들어있는 2 밀리리터 튜브에 조각을 넣습니다.
배양액을 섭씨 34도에서 배양하고 암시야 또는 위상차 현미경으로 처음 2주 동안은 매주 2회, 그 후 6주 동안은 매주 스피로헤타를 확인합니다. 혈액 샘플에서 Borrelia를 배양하려면 튜브에서 혈장을 부드럽게 제거하고 1 밀리리터의 혈장을 5 밀리리터의 예열 된 변형 된 Kelly-Pettenkofer 또는 MKP Complete 배지에 접종합니다. 피부 생검에서 Borrelia를 배양하려면 70 % 에탄올과 과산화수소로 피부 생검을 표면 멸균하십시오.
그런 다음 생검 샘플을 생리 식염수에 넣습니다. 생리 식염수에 담그는 동안 유리 페트리 접시에 멸균 면도날을 사용하여 샘플을 2-6 개의 작은 조각으로 깍둑 썰기합니다. 깍둑썰기한 샘플과 피부 생검을 보관한 식염수 1밀리리터를 항생제가 보충된 예열 배지 5밀리리터에 옮기고 섭씨 33도에서 배양합니다.
접시를 만들기 위해 젤라틴이없는 1.5x BSK 또는 MKP Complete 배지 300 밀리리터를 따뜻하게합니다. 또한 1.7 % 아가로즈 200 밀리리터를 섭씨 55도까지 따뜻하게합니다. 액체와 피펫 15 밀리리터를 각각 16 개의 깊은 페트리 접시에 혼합하여 바닥 한천 층을 만듭니다.
나머지 매체는 수조에 보관하십시오. Borrelia 배양 밀도를 정량화하고 액체 배지에서 원하는 밀도로 희석합니다. 바닥 플레이트가 굳은 후, 적절한 수의 스피로헤타가 들어있는 15 밀리리터 튜브에 상부 한천으로서 10 밀리리터의 남은 한천 혼합물을 첨가한다.
하단 한천 플레이트에 현탁액을 라벨이 붙은 페트리 접시에 붓습니다. 플레이트가 굳은 후 닫고 2.5 % 이산화탄소에 섭씨 34도에서 35도까지 거꾸로 놓습니다. 올바르게 준비되면 BSK 배지는 적색-주황색으로 투명하게 나타났습니다.
비교를 위해, MKP 미접종 배지도 여기에 나타내었다. 경쟁 박테리아에 의한 과증식은 배지에 탁도와 응집된 물질을 생성합니다. 박테리아 성장은 위상차 또는 암시야 현미경에 의한 육안 검사로 모니터링되었습니다.
지수 단계에서 Borrelia 세포는 일반적으로 어느 정도 가늘고 꼬여 있으며 모달입니다. 문화가 정지 단계에 들어감에 따라 둥근 몸체가 점점 더 분명해지고 있습니다. Borrelia 세포는 까다롭고 각 종과 균주 및 심지어 분리도 유전적으로 그리고 분리된 숙주에 대한 적응을 통해 다릅니다.
배지를 만들 때 적절한 재료는 보렐리아 문화의 활력이나 문화의 생존 가능성에 엄청난 차이를 만듭니다. Borrelia spirochetes는 문화에 도전하지만 문화는 가능합니다. 실험실에서의 배양은 이러한 박테리아의 생물학 연구의 발판입니다.
문화는 Borrelia 종의 게놈, 프로테옴, 진화 및 숙주 병원체 상호 작용을 이해하는 자료를 제공합니다. Borrelia 문화는 스피로헤타가 검출하기에 충분히 풍부해지기까지 몇 주가 걸릴 수 있습니다. 이는 진단 응용 프로그램을 제한합니다.
그러나 문화는 Borrelia 종이 존재하고, 생존 가능하고, 복제되는지 보여줄 수 있으며, 치료에 접근하는 데 도움이 될 수 있습니다.
