בורליה (שם מדעי: Borrelia) הוא סוג של חיידק ספירוצ'ט הכולל שלושה סוגים עיקריים. קבוצת ליים בורליוזיס, קבוצת קדחת התקפית, והקבוצה הפחות מאופיינת המצויה בזוחלים. מינים רבים של בורליה הם פתוגניים.
תרבית החיידקים היא תקן הזהב לזיהוי זיהום. זה נכון גם לגבי המחקר וגם לגבי העבודה הקלינית. תרבית החיידקים מנוזלי הגוף והרקמות מאשרת שהחיידקים הם גם בני קיימא וגם משתכפלים.
פרוטוקול זה מדגים את המתודולוגיה והמתכונים הדרושים לתרבית ושימור מוצלחים של קבוצת הספירוצ'טות ליים בורליוזיס, בורליה קדחת התקפית ובורליה מיאמוטי. שיטות מסופקות לתרבות של מינים וזנים שבודדו בעבר, כמו גם מבודדים חדשים ומבודדים חד שבטיים ממקורות סביבתיים או יונקים. הדגמת ההליך תהיה מארי-ליין פוקיליון, חוקרת פוסט-דוקטורט, ואינגלה נילסון, טכנאית ממעבדת ברגסטרום, אן ברטהולד, עמיתת מחקר ממעבדת לויד, ומרינה גולובצ'נקו, עמיתת מחקר ממעבדת רודנקו.
כדי להתחיל, להשיג את הריאגנטים הדרושים להכנת ליטר אחד של ברברה-סטונר-קלי, או מדיום BSK-II. התחל עם המסת BSA בכוס על ידי ערבוב המים. לאחר מכן מוסיפים את כל הכימיקלים היבשים ונותנים להם להתמוסס לפני הוספת CMRL.
התאם את ה- pH של המדיום ל -7.6. במידת הצורך, השתמש בנתרן הידרוקסידי מולארי אחד. לאחר מכן, להוסיף סרום ארנב למדיום לריכוז של 6% עד 10% אם צמיחת החיידקים אינה חזקה, להוסיף עוד אחד עד 2% סרום למדיום.
לאחר מכן לעקר את המדיום באמצעות מסנן נקבוביות 0.22 מיקרון. להקפיא את המלאי של בינוני ב 100 או 400 מיליליטר aliquots. עבור זני חום התקפי, הוסף 100 מיליליטר של 7% ג'לטין סטרילי ל 400 מיליליטר של מדיום BSK-II.
יש לחטא את פני השטח ואת כל החומרים באתנול 7% ולהעבירם מיד לארון הבטיחות הביולוגי. UV לעקר את כל החומרים שאינם ביולוגיים במשך חמש דקות לפני תחילת העבודה. כדי להתחיל תרבות, מראש לחמם את המדיום באינקובטור.
לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של תרבית בורליה מופשרת מציר גליצרול לחמישה עד 15 מיליליטר של מדיום BSK שחומם מראש. מלאו את הצינורות כמעט לחלוטין כדי ליצור אווירה מיקרו או אנאירובית לפני סגירתם. מגדלים מיני קדחת התקפית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ומיני Borrelia burgdorferi sensu lato בטמפרטורה של 33 עד 34 מעלות צלזיוס.
עקוב אחר צמיחת תרבית בורליה באמצעות ניגודיות פאזה או מיקרוסקופ שדה כהה בהגדלה של פי 200 עד 400. כדי להבטיח פיזור אחיד של תאים, לערבב את התרבית עם פיפטה סרולוגית או להשתמש פיפטה העברה של שלושה מיליליטר תוך כדי pipeting למעלה ולמטה. לאחר מכן לטעון 10-מיקרוליטר תרבית aliquot בכל צד של hemocytometer לספירה.
לאחר מכן, לדלל את תרבית בורליה פאזה מעריכית ביחס של אחד לשניים או אחד לארבעה עם מדיום בצינור 1.7 מיליליטר. בעת קביעת ספירת התא, שקול את גורם הדילול כראוי. לאחר השימוש, רססו את המשטחים ואת ההמוציטומטר באקונומיקה מדוללת 10% ו/או 70% אתנול.
עבור מיצוי של DNA או בידוד של תאי Borrelia, צנטריפוגה את תרבית הפאזה המעריכית במשך 10 דקות ב 4, 000 G ולהשליך את supernatant בפסולת biohazard מתאים. לעבד את החיידקים הכדוריים עם ערכת מיצוי DNA מסחרית או להשעות אותם מחדש במדיום מתאים לניסוי המיועד. בסוף כל ניסוי, לעקר את כל הציוד עם אתנול וקרינת UV.
יש לאסוף את הפסולת הנוזלית, כולל עודפי תרבית, בבקבוק אשפה ולהוסיף 10% אקונומיקה. מניחים את הבקבוק על 80 מעלות צלזיוס לפני השלכתו. לאחסון ארוך טווח של תרביות בורליה, קחו את הנפח הרצוי של תרבית פאזה מעריכית של 10 מיליון עד 100 מיליון תאים למיליליטר, הוסיפו גליצרול סטרילי של 10%, וערבבו על ידי פיפטציה למעלה ולמטה.
מעבירים 1.5 מיליליטר aliquots של התערובת לתוך שני בקבוקונים קריוגניים מכסה בורג מיליליטר. אחסנו את בקבוקוני המלאי בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. החזיקו במקפיא מלאי עם לפחות 10 צינורות מכל זן, כדי לגדל בורליה מקרציות קשות, אספו נקבות בוגרות, זכרים וקרציות נימפה.
יש לעקר את הקרציות על ידי טבילתן באתנול 70% למשך שתי דקות ולייבש באוויר בארון בטיחות ביולוגית. לאחר מכן, לנתח את הקרציות בנפרד למספר חתיכות באמצעות אזמל סטרילי. לאחר מכן מניחים את החתיכות לתוך צינור שני מיליליטר המכיל 1.5 מיליליטר של המדיום בתוספת אנטיביוטיקה.
לדגור על התרביות בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס ולבדוק אם יש ספירוצ'טות על ידי שדה כהה או מיקרוסקופ ניגודיות פאזה פעמיים בשבוע בשבועיים הראשונים ומדי שבוע לאחר מכן במשך שישה שבועות. כדי לטפח Borrelia מדגימות דם, להסיר בעדינות את הפלזמה מן הצינור ולחסן מיליליטר אחד של פלזמה לתוך חמישה מיליליטר של שחומם מראש, שונה Kelly-Pettenkofer או MKP Complete בינוני. לטיפוח בורליה מביופסיה של העור, משטח לעקר את ביופסיית העור עם 70% אתנול ומי חמצן.
לאחר מכן מניחים את דגימת הביופסיה במי מלח פיזיולוגיים. חתכו את הדגימה לשתיים עד שש חתיכות קטנות יותר באמצעות סכין גילוח סטרילית בצלחת פטרי מזכוכית בעודכם שקועים במי מלח פיזיולוגיים. מעבירים את הדגימה הקצוצה ומיליליטר אחד של מי מלח שבהם אוחסנה ביופסיית העור לחמישה מיליליטר של מדיום שחומם מראש בתוספת אנטיביוטיקה, ודגרים בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס.
להכנת צלחות, לחמם 300 מיליליטר של 1.5x BSK או MKP מדיום שלם ללא ג'לטין. גם חם 200 מיליליטר של 1.7% agarose ל 55 מעלות צלזיוס. מערבבים את הנוזלים והפיפטה 15 מיליליטר כל אחד על 16 צלחות פטרי עמוקות ליצירת שכבת אגר תחתונה.
שמור על שאר המדיום באמבט מים. לכמת את צפיפות תרבית בורליה ולדלל לצפיפות הרצויה בתווך נוזלי. לאחר שהלוחות התחתונים התמצקו, הוסיפו 10 מיליליטר מתערובת האגר הנותרת כאגר עליון לשפופרת 15 מיליליטר המכילה את המספר המתאים של ספירוצ'טים.
יוצקים את המתלים על צלחת האגר התחתונה לתוך צלחת פטרי המסומנת. לאחר שהלוחות מתמצקים, סוגרים אותם ומניחים אותם הפוכים בטמפרטורה של 34 עד 35 מעלות צלזיוס בפחמן דו חמצני של 2.5%. כאשר הוכן כראוי, המדיום BSK נראה אדום-כתום וברור.
לשם השוואה, מדיום לא מחוסן MKP מוצג גם כאן. צמיחת היתר על ידי חיידקים מתחרים יוצרת עכירות וחומרים גושים בתווך. צמיחת החיידקים נוטרה על ידי בדיקה חזותית על ידי ניגודיות פאזה או מיקרוסקופ שדה כהה.
בשלב המעריכי, תאי Borrelia הם בדרך כלל דקים, מעוותים ומודאליים במידה מסוימת. ככל שהתרבויות נכנסות לשלב הנייח, גופים עגולים ניכרים יותר ויותר. תאי בורליה הם קשיחים וכל מין וזן ואף מבודד נבדלים זה מזה הן גנטית והן באמצעות הסתגלות לפונדקאי ממנו בודדו.
בעת יצירת מדיה, מרכיבים מתאימים עושים הבדל עצום בעוצמה של תרבות בורליה או אפילו בכדאיות של התרבות. ספירוצ'טות בורליה מאתגרות את התרבות, אבל תרבות אפשרית. תרבית במעבדה היא קרש קפיצה למחקר על הביולוגיה של חיידקים אלה.
התרבות מספקת את החומר להבנת הגנום, הפרוטום, האבולוציה והאינטראקציות הפתוגנים של המין בורליה. תרבית בורליה יכולה לקחת מספר שבועות לפני שספירוצ'טות יהיו מספיק בשפע לזיהוי. פעולה זו מגבילה יישומי אבחון.
אבל התרבות יכולה להראות אם מיני בורליה נוכחים, בני קיימא ומשתכפלים, והיא יכולה לעזור לגשת לטיפולים.
