生物膜形成微生物是食品工业（包括乳制品工业）的主要问题。由于它们对产品质量的负面影响，因此制定生物膜控制策略非常重要。这种方法结合了静态高通量筛选方法和模拟原位条件的动态方法。
这两种方法对于研究消毒剂对生物膜的功效是互补的。这种方法可用于测试新的生物或化学配方，以控制食品、医疗或环境领域的生物膜。首先涡旋偶氮假单胞菌细菌培养管。
无菌将100微升细菌培养物转移到10毫升无菌胰蛋白酶大豆肉汤或TSB培养基中，以达到每毫升约10至第七CFU的两倍的终浓度。涡旋培养管。然后使用多通道移液器，将150微升稀释的细菌培养物一式三份转移到生物膜微量滴定板孔中。
将150微升TSB培养基装入三个新孔中作为对照。接下来，将生物膜微量滴定板在30摄氏度下孵育24小时而不搅拌。清洁并风干生物反应器的部件，然后将扁平刀片放入通过磁棒连接到支架的一升玻璃烧杯内。
使用连接到生物反应器盖内侧的塑料条保持设置直立。使用螺丝刀将不锈钢试样或滑块放在聚丙烯棒上。将试样或滑轨插入盖子上的孔中，不要将其定位销放在凹口中，以免蒸汽在灭菌过程中逸出。
用铝箔覆盖所有生物反应器通风口，并用铝箔包裹其余设备，即 18 号管和 16 号管、玻璃流制动器、容器盖、螺丝刀、镊子和 0.2 微米过滤器。将生物反应器在121摄氏度的干循环中高压灭菌20分钟。为了以间歇模式在生物反应器中执行生物膜形成的第一步，在生物安全柜内，将 18 号管道的一端连接到生物反应器的出口，并保持另一端包裹在铝箔中。
从生物反应器盖上取下一个试样或载玻片支架，并将其放入无菌50毫升管中。然后使用50毫升血清移液器，通过棒占据的孔向生物反应器烧杯填充340毫升每毫升300毫克TSB培养基。为了在生物反应器中接种培养基，使用五毫升移液管通过孔口向每毫升偶氮假单胞菌细菌溶液中的第八个CFU中加入一毫升10，并将杆放回其原始位置。
将已放置在盖孔中的杆定位，以使销钉适合相应的凹口。然后将0.2微米的细菌空气吹扫过滤器放在位于生物反应器盖子上的最小直径管的末端。另一根相同直径的管子仍然用金属螺帽或紧密关闭的硅胶塞永久堵塞。
将生物反应器放在设定在30摄氏度的加热板上24小时，并以130 RPM搅拌。24小时后，在连续流动模式下在生物反应器中执行生物膜形成的第二步。将装有18升无菌蒸馏水的大瓶放入生物安全柜中。
然后加入两升每升1000毫克的TSB培养基，以获得每升100毫克的终浓度。用连接两根管子的无菌盖盖住容器。第一个是固定在盖子接口上的硅胶管，用于泵送介质。
第二个16号管连接到外部端口，允许液体流向生物反应器。将 16 号管连接到玻璃流动制动器的末端后，将后者的另一端插入生物反应器盖上最大的管中，然后将 16 号管安装在蠕动泵中。使用另一个 20 升大瓶收集生物反应器的流出物。
将连接到生物反应器出口出水口的管端连接到废物容器的盖子上。将0.2微米过滤器插入该容器盖上的管中。完成后，以每分钟 11.3 毫升的流速启动蠕动泵，并使系统运行 24 小时。
24小时后，关闭蠕动泵，停止搅拌和加热生物反应器。要恢复细菌生物膜，请在40毫升PBS中冲洗优惠券或载玻片以消除浮游细菌。然后将它们释放到含有40毫升PBS的无菌50毫升锥形管中。
涡旋 30 秒后，以 40 千赫兹的速度对试管进行超声处理 30 秒。重复此操作三次。完成后，将40毫升生物膜悬浮液收集在无菌的50毫升锥形管中，并用两种无菌PBS溶液冲洗试样或载玻片。
回收这种漂洗液并将其添加到已经收集的生物膜悬浮液中。从30摄氏度下取出微量滴定板。将 200 微升 PBS 加入 96 孔微孔板的三个孔中。
为了清洗生物膜并消除浮游细菌，将带有在钉子上形成的生物膜的生物膜微孔板的盖子转移到含有PBS的96孔微孔板上10秒。准备所需浓度的消毒剂，并将每种消毒剂浓度的200微升一式三份加入新的96孔微量滴定板的孔中。将生物膜微量滴定板的盖子转移到含有消毒剂的96孔微量滴定板上，并在室温下孵育板所需的曝光时间。
接下来，将 200 微升 Dey-Engley 中和肉汤添加到新的 96 孔微量滴定板的孔中。将生物膜微量滴定板的盖子转移到含有中和肉汤的96孔微量滴定板上。用封口膜密封微量滴定板，并将其放入40千赫兹的浴超声仪中30分钟。
30分钟后，从超声板的第一列，将100微升分离的生物膜转移到新的96孔微量滴定板的第一排。然后将 180 微升无菌 PBS 加入 96 孔板中，第一排除外。接下来，将20微升生物膜溶液从第一行转移到含有180微升PBS的第二排孔中，以达到稀释10至负1。
然后将20微升从第二排转移到下一行的孔中，以达到10到负2的稀释度。重复此操作以获得 10 至负 5 和 10 至负 7 之间的稀释度。在TSA上接种100微升所需的稀释液，并根据细菌的生长参数孵育板。
在生物反应器的试样上形成偶氮假单胞菌PFLA 1生物膜，取出装有试样的杆，并在含有30毫升PBS的锥形管内冲洗棒以去除浮游细胞。使用螺丝刀将每张优惠券放入无菌的 50 毫升锥形管中。然后加入四毫升适当的有机过氧酸溶液或PBS用于对照。
孵育五分钟后，加入 36 毫升 Dey-Engley 中和肉汤。将锥形管涡旋 30 秒后，以 40 千赫兹的速度对其进行超声处理 30 秒。重复该过程三次以获得生物膜悬浮液。
用其他棒重复相同的步骤，制备生物膜悬浮液的连续妄想，并如前所述将悬浮液铺在TSA培养基上。SCM分析显示偶氮假单胞菌PFL1A在生物膜微孔板钉上存在生物膜。使用生物反应器在不锈钢载玻片上形成的偶氮假单胞菌PFL1A生物膜看起来非常致密，并显示出成熟三维生物膜的形态特征。
该分离株在动态系统中产生的生物膜的细菌计数结果显示，TSB培养基中显着的细胞密度对应于每平方厘米8.74 log CFU，无菌脱脂牛奶中对应于7.86 log CFU平方厘米。用B.vesicularis分离物获得的结果表明，营养浓度从每升100毫克增加到900毫克导致生物膜的细菌计数从6.11 log CFU平方厘米增加到8.71log CFU平方厘米。此外，当流速降低到每分钟6.0毫升时，观察到显着的生物膜生长，表明某些因素可能会影响生物反应器中生物膜的形成。
在五分钟的接触时间内，没有一个生物膜含有可检测的活细胞，其中有机过氧酸为百万分之500，百万分之一，过氧化氢浓度的消毒剂通常应用于乳制品厂。SCM表现出未处理的最小生物膜根除浓度或MBEC生物膜的三维结构，而处理后的MBEC生物膜则失去了三维构象。在执行此协议时必须保持无菌状态。
此外，用户必须记住，生成的结果与独特的分离物和消毒剂相关联。可以评估将消毒剂与机械振动、超声或酶处理相结合，以提高生物膜根除的功效。这种方法使用静态和动态方法形成生物膜，为研究人员筛选和研究新的抗生物膜配方铺平了道路，以更好地控制各个领域的生物膜。
