Los microorganismos formadores de biopelículas son un problema importante en la industria alimentaria, incluida la industria láctea. Debido a su impacto negativo en la calidad de los productos, entonces es importante desarrollar estrategias de control de biopelículas. Este enfoque combina un método de cribado estático de alto rendimiento y un método dinámico que imita las condiciones in situ.
Estos dos métodos son complementarios para estudiar la eficacia de los desinfectantes contra las biopelículas. Este enfoque se puede utilizar para probar nuevas formulaciones biológicas o químicas para controlar las biopelículas en los sectores alimentario, médico o ambiental. Comience por vortexing los tubos de cultivo bacteriano Pseudomonas azotoformans.
Transfiera asépticamente 100 microlitros del cultivo bacteriano a 10 mililitros de caldo de soja tríptico estéril o medio TSB para lograr la concentración final de aproximadamente dos veces 10 a la séptima UFC por mililitro. Vórtice el tubo de cultivo. Luego, utilizando una pipeta multicanal, transfiera 150 microlitros del cultivo bacteriano diluido en los pocillos de la placa de microtitulación de biopelícula por triplicado.
Cargar 150 microlitros de TSB medio en tres nuevos pozos como control. A continuación, incube la placa de microtitulación de biofilm a 30 grados centígrados durante 24 horas sin agitación. Limpie y seque al aire las partes del biorreactor antes de colocar la cuchilla plana dentro del vaso de precipitados de vidrio de un litro unido al soporte por una barra magnética.
Mantenga la configuración en posición vertical utilizando la barra de plástico unida al lado interior de la tapa del biorreactor. Utilice el destornillador para colocar los cupones o guías de acero inoxidable en sus varillas de polipropileno. Inserte cupones o guías en los orificios de la tapa sin colocar sus pasadores de alineación en las muescas que permitan que el vapor escape durante la esterilización.
Cubra todas las rejillas de ventilación del biorreactor con papel de aluminio y envuelva el resto del equipo, a saber, el tubo de tamaño 18 y el tubo de tamaño 16, el freno de flujo de vidrio, las tapas del contenedor, los destornilladores, las pinzas y los filtros de 0,2 micrómetros con papel de aluminio. Autoclave el biorreactor configurado en un ciclo seco a 121 grados centígrados durante 20 minutos. Para realizar el primer paso de la formación de biopelícula en el biorreactor en modo discontinuo, dentro de un gabinete de seguridad biológica, conecte un extremo del tubo de tamaño 18 al pico de salida del biorreactor y mantenga el otro extremo envuelto en papel de aluminio.
Retire un cupón o portaportaobjetos de la tapa del biorreactor y colóquelo en un tubo estéril de 50 mililitros. Luego, utilizando una pipeta serológica de 50 mililitros, llene el vaso de precipitados del biorreactor con 340 mililitros de 300 miligramos por mililitro de medio TSB a través del orificio ocupado por la varilla. Para inocular el medio de cultivo en el biorreactor, añadir un mililitro de 10 a la octava UFC por mililitro de solución bacteriana de Pseudomonas azotoformans a través del orificio utilizando una pipeta de cinco mililitros y volver a colocar la varilla en su posición original.
Coloque las varillas ya colocadas en los orificios de la tapa para que los pasadores encajen en las muescas respectivas. Luego coloque un filtro de purga de aire bacteriano de 0.2 micrómetros en el extremo del tubo de diámetro más pequeño ubicado en la tapa del biorreactor. El otro tubo del mismo diámetro permanece permanentemente tapado con un tapón de rosca de metal o un tapón de silicona que se cierra herméticamente.
Coloque el biorreactor durante 24 horas sobre la placa calefactora fijada a 30 grados centígrados y revuelva a 130 RPM. Después de 24 horas, realice el segundo paso de la formación de biopelícula en el biorreactor en modo de flujo continuo. Coloque una garrafa que contenga 18 litros de agua destilada estéril en el gabinete de bioseguridad.
Luego agregue dos litros de 1000 miligramos por litro de medio de cultivo de cucharada para obtener una concentración final de 100 miligramos por litro. Cubra el recipiente con su tapón estéril al que están conectados dos tubos. El primero es un tubo de silicona fijado en la interfaz de la tapa para bombear el medio.
El segundo, el tubo de tamaño 16, está conectado al puerto externo permitiendo que el líquido fluya hacia el biorreactor. Después de conectar el tubo de tamaño 16 al extremo del freno de flujo de vidrio, inserte este último en el tubo más grande de la tapa del biorreactor por su otro extremo y luego instale el tubo de tamaño 16 en la bomba peristáltica. Utilice otra garrafa de 20 litros para recoger el efluente del biorreactor.
Fije el extremo del tubo conectado al pico de salida del biorreactor a la tapa del contenedor de residuos. Inserte un filtro de 0,2 micrómetros en el tubo presente en la tapa de este recipiente. Una vez hecho esto, arranque la bomba peristáltica a un caudal de 11,3 mililitros por minuto y deje el sistema funcionando durante 24 horas.
Después de 24 horas, apague la bomba peristáltica y deje de agitar y calentar el biorreactor. Para recuperar el biofilm bacteriano, enjuague los cupones o portaobjetos en 40 mililitros de PBS para eliminar las bacterias planctónicas. Luego suéltelos en un tubo cónico estéril de 50 mililitros que contiene 40 mililitros de PBS.
Después de 30 segundos de vórtice, sonicar los tubos a 40 kilohercios durante 30 segundos. Repita esto tres veces. Una vez hecho esto, recoja los 40 mililitros de suspensión de biofilm en un tubo cónico estéril de 50 mililitros y enjuague los cupones o portaobjetos con dos de solución estéril de PBS.
Recupere este líquido de enjuague y agréguelo a la suspensión de biofilm ya recolectada. Saque la placa de microtitulación a partir de 30 grados centígrados. Agregue 200 microlitros de PBS en tres pocillos de una microplaca de 96 pocillos.
Para lavar las biopelículas y eliminar las bacterias planctónicas, transfiera la tapa de la microplaca de biopelícula con biopelículas formadas en las clavijas a la microplaca de 96 pocillos que contiene el PBS durante 10 segundos. Prepare los desinfectantes en las concentraciones requeridas y agregue 200 microlitros de cada concentración de desinfectante en los pocillos de una nueva placa de microtitulación de 96 pocillos por triplicado. Transfiera la tapa de la placa de microtitulación de biofilm a la placa de microtitulación de 96 pocillos que contiene los desinfectantes e incube la placa a temperatura ambiente durante el tiempo de exposición deseado.
A continuación, agregue 200 microlitros de caldo neutralizante Dey-Engley a los pocillos de una nueva placa de microtitulación de 96 pocillos. Transfiera la tapa de la placa de microtitulación de biopelícula a la placa de microtitulación de 96 pocillos que contiene el caldo neutralizante. Selle la placa de microtitulación con parafilm y colóquela en el sonicador de baño a 40 kilohercios durante 30 minutos.
Después de 30 minutos, desde la primera columna de la placa sonicada, transfiera 100 microlitros de biopelículas separadas a la primera fila de una nueva placa de microtitulación de 96 pocillos. Luego agregue 180 microlitros de PBS estéril a una placa de 96 pocillos, excepto la primera fila. A continuación, transfiera 20 microlitros de la solución de biopelícula de la primera fila a los pocillos en la segunda fila que contienen 180 microlitros de PBS para lograr la dilución de 10 a menos uno.
Luego transfiera 20 microlitros de la segunda fila a los pozos en la siguiente fila para lograr la dilución de 10 a menos dos. Repita esto para obtener una dilución entre 10 a menos cinco y 10 a menos siete. Inocular 100 microlitros de la dilución deseada en TSA e incubar las placas según los parámetros de crecimiento de la bacteria.
Forme las biopelículas PFLA 1 de Pseudomonas azotoformans en los cupones en el biorreactor, retire la varilla que contiene los cupones y enjuague la varilla dentro de un tubo cónico que contiene 30 mililitros de PBS para eliminar las células planctónicas. Coloque cada cupón en un tubo cónico estéril de 50 mililitros con un destornillador. Luego agregue cuatro mililitros de la solución orgánica de peroxiácido apropiada o PBS para el control.
Después de cinco minutos de incubación, agregue 36 mililitros de caldo neutralizante Dey-Engley. Después de vortex el tubo cónico durante 30 segundos, sonicarlo a 40 kilohercios durante 30 segundos. Repita el proceso tres veces para obtener la suspensión de biofilm.
Repita el mismo procedimiento con las otras varillas, prepare delirios seriados de la suspensión de biopelícula y coloque la suspensión en medio TSA como se describió anteriormente. El análisis SCM mostró la presencia del biofilm por Pseudomonas azotoformans PFL1A en las clavijas de microplacas del biofilm. La biopelícula PFL1A de Pseudomonas azotoformans formada en un portaobjetos de acero inoxidable utilizando un biorreactor parecía muy densa y mostraba las características morfológicas de una biopelícula tridimensional madura.
Los resultados de los recuentos bacterianos de las biopelículas desarrolladas por este aislado en el sistema dinámico mostraron densidades celulares significativas correspondientes a 8,74 log UFC por centímetro cuadrado en medio de cultivo TSB y 7,86 log UFC centímetro cuadrado en leche descremada estéril. Los resultados obtenidos con el aislado de B.vesicularis mostraron que el aumento en la concentración de nutrientes de 100 a 900 miligramos por litro resultó en un aumento en el recuento bacteriano de las biopelículas de 6.11 a 8.71 log CFU centímetro cuadrado. Además, se observó un crecimiento significativo de la biopelícula cuando el caudal se redujo a 6,0 mililitros por minuto, lo que indica que ciertos factores podrían influir en la formación de biopelículas en el biorreactor.
Ninguna de las biopelículas contenía células viables detectables a cinco minutos de tiempo de contacto en 500 partes por millón con peroxiácidos orgánicos y 100.000 partes por millón con concentraciones de peróxido de hidrógeno de desinfectantes generalmente aplicados en plantas lecheras. El SCM mostró la estructura tridimensional de la concentración mínima de erradicación de biopelículas no tratadas o biopelículas MBEC, mientras que las biopelículas MBEC tratadas perdieron su conformación tridimensional. Es esencial permanecer bajo la condición estéril mientras se realiza este protocolo.
Además, el usuario debe recordar que los resultados generados están asociados con un aislado y desinfectante únicos. La combinación de desinfectante con vibración mecánica, ultrasonido o tratamientos enzimáticos podría evaluarse para mejorar la eficacia de la erradicación de biopelículas. Este enfoque que utiliza métodos estáticos y dinámicos para formar biopelículas allanó el camino para que los investigadores examinaran y estudiaran nuevas formulaciones antibiopelículas para controlar mejor las biopelículas en diversos sectores.
