Avaliação da Eficácia dos Perácidos Orgânicos na Erradicação de Biofilmes Laticínios Usando uma Abordagem Combinando Métodos Estáticos e Dinâmicos

Os microrganismos formadores de biofilme são uma questão importante na indústria alimentícia, incluindo a indústria de laticínios. Devido ao seu impacto negativo na qualidade dos produtos, então é importante desenvolver estratégias de controle de biofilme. Essa abordagem combina um método estático de triagem de alto rendimento e um método dinâmico que imita as condições in situ.

Esses dois métodos são complementares para o estudo da eficácia dos desinfetantes contra biofilmes. Essa abordagem pode ser usada para testar novas formulações biológicas ou químicas para controlar biofilmes nos setores alimentício, médico ou ambiental. Comece por vórtice dos tubos de cultura bacteriana de Pseudomonas azotoformans.

Transfira assepticamente 100 microlitros da cultura bacteriana para 10 mililitros de caldo de soja tríptico estéril ou meio TSB para atingir a concentração final de aproximadamente duas vezes 10 até a sétima UFC por mililitro. Vórtice o tubo de cultura. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, transfira 150 microlitros da cultura bacteriana diluída nos poços de placa de microtitulação de biofilme em triplicado.

Carregar 150 microlitros de meio TSB em três novos poços como controle. Em seguida, incube a placa de microtitulação de biofilme a 30 graus Celsius por 24 horas sem agitação. Limpe e seque ao ar as partes do biorreator antes de colocar a lâmina plana dentro do copo de vidro de um litro preso ao suporte por uma barra magnética.

Mantenha a configuração na posição vertical usando a barra de plástico presa ao lado interno da tampa do biorreator. Use a chave de fenda para colocar os cupons de aço inoxidável ou slides em suas hastes de polipropileno. Insira cupons ou deslizamentos nos orifícios da tampa sem colocar seus pinos de alinhamento nos entalhes, permitindo que o vapor escape durante a esterilização.

Cubra todas as aberturas do biorreator com folha de alumínio e envolva o resto do equipamento, nomeadamente a tubulação tamanho 18 e a tubulação tamanho 16, o freio de fluxo de vidro, as tampas do recipiente, as chaves de fenda, a pinça e os filtros de 0,2 micrômetro com folha de alumínio. Autoclave o biorreator configurado em um ciclo seco a 121 graus Celsius por 20 minutos. Para realizar a primeira etapa da formação do biofilme no biorreator em modo de batela, dentro de um gabinete de segurança biológica, conecte uma extremidade da tubulação tamanho 18 ao bico de saída do biorreator e mantenha a outra extremidade envolta em folha de alumínio.

Remova um cupom ou suporte deslizante da tampa do biorreator e coloque-o em um tubo estéril de 50 mililitros. Em seguida, usando uma pipeta sorológica de 50 mililitros, encha o copo do biorreator com 340 mililitros de 300 miligramas por mililitro de meio TSB através do orifício ocupado pela haste. Para inocular o meio de cultura no biorreator, adicione um mililitro de 10 à oitava UFC por mililitro de solução bacteriana de Pseudomonas azotoformans através do orifício usando uma pipeta de cinco mililitros e coloque a haste de volta à sua posição original.

Posicione as hastes já colocadas nos orifícios da tampa para que os pinos caibam nos respectivos entalhes. Em seguida, coloque um filtro de purga de ar bacteriano de 0,2 micrômetro no final do tubo de menor diâmetro localizado na tampa do biorreator. O outro tubo do mesmo diâmetro permanece permanentemente entupido com uma tampa de rosca de metal ou um plugue de silicone que se fecha firmemente.

Coloque o biorreator por 24 horas sobre a placa de aquecimento ajustada a 30 graus Celsius e mexa a 130 RPM. Após 24 horas, realizar a segunda etapa da formação do biofilme no biorreator em modo de fluxo contínuo. Coloque um garrafão contendo 18 litros de água destilada estéril no armário de biossegurança.

Em seguida, adicione dois litros de 1000 miligramas por litro de meio de cultura TSB para obter uma concentração final de 100 miligramas por litro. Cubra o recipiente com sua tampa estéril à qual dois tubos estão conectados. O primeiro é um tubo de silicone fixado na interface da tampa para bombear o meio.

O segundo, o tubo de tamanho 16, é conectado à porta externa, permitindo que o líquido flua em direção ao biorreator. Depois de conectar a tubulação de tamanho 16 à extremidade do freio de fluxo de vidro, insira este último no maior tubo na tampa do biorreator por sua outra extremidade e, em seguida, instale a tubulação de tamanho 16 na bomba peristáltica. Use outro garrafão de 20 litros para coletar o efluente do biorreator.

Fixar a extremidade do tubo ligado à bica de saída do biorreactor à tampa do recipiente de resíduos. Insira um filtro de 0,2 micrômetro no tubo presente na tampa deste recipiente. Uma vez feito, ligue a bomba peristáltica a uma taxa de fluxo de 11,3 mililitros por minuto e deixe o sistema funcionando por 24 horas.

Após 24 horas, desligue a bomba peristáltica e pare de mexer e aquecer o biorreator. Para recuperar o biofilme bacteriano, lave os cupons ou lâminas em 40 mililitros de PBS para eliminar as bactérias planctônicas. Em seguida, solte-os em um tubo cônico estéril de 50 mililitros contendo 40 mililitros de PBS.

Após 30 segundos de vórtice, sonicate os tubos a 40 kilohertz por 30 segundos. Repita isso três vezes. Uma vez feito, colete os 40 mililitros de suspensão de biofilme em um tubo cônico estéril de 50 mililitros e enxágue os cupons ou lâminas com dois de solução estéril de PBS.

Recupere este líquido de enxágue e adicione-o à suspensão de biofilme já recolhida. Retire a placa de microtitulação de 30 graus Celsius. Adicione 200 microlitros de PBS em três poços de uma microplaca de 96 poços.

Para lavar os biofilmes e eliminar as bactérias planctônicas, transfira a tampa da microplaca de biofilme com biofilmes formados nos pinos para a microplaca de 96 poços contendo o PBS por 10 segundos. Prepare os desinfetantes nas concentrações necessárias e adicione 200 microlitros de cada concentração de desinfetante nos poços de uma nova placa de microtitulação de 96 poços em triplicata. Transfira a tampa da placa de microtitulação de biofilme para a placa de microtitulação de 96 poços contendo os desinfetantes e incube a placa à temperatura ambiente durante o tempo de exposição desejado.

Em seguida, adicione 200 microlitros de caldo neutralizante Dey-Engley aos poços de uma nova placa de microtitulação de 96 poços. Transfira a tampa da placa de microtitulação de biofilme para a placa de microtitulação de 96 poços contendo o caldo neutralizante. Sele a placa de microtitulação com parafilme e coloque-a no sonicator de banho a 40 kilohertz por 30 minutos.

Após 30 minutos, a partir da primeira coluna da placa sonicada, transfira 100 microlitros de biofilmes destacados para a primeira fileira de uma nova placa de microtitulação de 96 poços. Em seguida, adicione 180 microlitros de PBS estéril a uma placa de 96 poços, exceto para a primeira linha. Em seguida, transfira 20 microlitros da solução de biofilme da primeira fileira para os poços na segunda fileira contendo 180 microlitros de PBS para obter a diluição de 10 para a menos um.

Em seguida, transfira 20 microlitros da segunda fileira para os poços na próxima linha para obter a diluição de 10 para menos dois. Repita isto para obter diluição entre 10 a menos cinco e 10 a menos sete. Inocular 100 microlitros da diluição desejada em TSA e incubar as placas de acordo com os parâmetros de crescimento da bactéria.

Forme os biofilmes de Pseudomonas azotoformans PFLA 1 nos cupons no biorreator, remova a haste que contém os cupons e enxágue a haste dentro de um tubo cônico contendo 30 mililitros de PBS para remover células planctônicas. Solte cada cupom em um tubo cônico estéril de 50 mililitros usando uma chave de fenda. Em seguida, adicione quatro mililitros da solução de peroxiácido orgânico apropriado ou PBS para o controle.

Após cinco minutos de incubação, adicione 36 mililitros de caldo neutralizante Dey-Engley. Depois de vórtice do tubo cônico por 30 segundos, sonice-os a 40 kilohertz por 30 segundos. Repita o processo três vezes para obter a suspensão de biofilme.

Repita o mesmo procedimento com as outras hastes, prepare delírios em série da suspensão de biofilme e coloque a suspensão em meio TSA, conforme descrito anteriormente. A análise do SCM mostrou a presença do biofilme de Pseudomonas azotoformans PFL1A nos pinos de microplacas de biofilme. O biofilme PFL1A de Pseudomonas azotoformans formado em uma lâmina de aço inoxidável utilizando um biorreator mostrou-se muito denso e apresentou as características morfológicas de um biofilme tridimensional maduro.

Os resultados das contagens bacterianas dos biofilmes desenvolvidos por este isolado no sistema dinâmico mostraram densidades celulares significativas correspondentes a 8,74 log UFC por centímetro quadrado em meio de cultura TSB e 7,86 log CFU centímetro quadrado em leite desnatado estéril. Os resultados obtidos com o isolado de B.vesicularis mostraram que o aumento da concentração de nutrientes de 100 para 900 miligramas por litro resultou em um aumento na contagem bacteriana dos biofilmes de 6,11 para 8,71 log CFU centímetros quadrados. Além disso, o crescimento significativo do biofilme foi observado quando a taxa de fluxo foi reduzida para 6,0 mililitros por minuto, indicando que certos fatores poderiam influenciar a formação de biofilme no biorreator.

Nenhum dos biofilmes continha células viáveis detectáveis em cinco minutos de tempo de contato em 500 partes por milhão com perácidos orgânicos e 100.000 partes por milhão com concentrações de peróxido de hidrogênio de desinfetantes geralmente aplicados em plantas leiteiras. O SCM mostrou a estrutura tridimensional da concentração mínima de erradicação de biofilme não tratada ou biofilmes MBEC, enquanto os biofilmes MBEC tratados perderam sua conformação tridimensional. É essencial permanecer sob a condição estéril durante a realização deste protocolo.

Além disso, o usuário deve lembrar que o resultado gerado está associado a um isolado e desinfetante exclusivo. A combinação de desinfetante com vibração mecânica, ultrassom ou tratamentos enzimáticos pode ser avaliada para melhorar a eficácia da erradicação do biofilme. Essa abordagem usando métodos estáticos e dinâmicos para formar biofilmes abriu o caminho para os pesquisadores rastrearem e estudarem novas formulações anti-biofilme para controlar melhor os biofilmes em vários setores.