Биопленкообразующие микроорганизмы являются серьезной проблемой в пищевой промышленности, в том числе в молочной промышленности. Из-за их негативного влияния на качество продукции важно разработать стратегии борьбы с биопленкой. Этот подход сочетает в себе метод статического высокопроизводительного скрининга и динамический метод, имитирующий условия на месте.
Эти два метода дополняют друг друга для изучения эффективности дезинфицирующих средств против биопленок. Этот подход может быть использован для тестирования новых биологических или химических составов для контроля биопленок в пищевой, медицинской или экологической отраслях. Начните с вихревого пробирки бактериальной культуры Pseudomonas azotoformans.
Асептически переносят 100 микролитров бактериальной культуры в 10 миллилитров стерильного триптического соевого бульона или среды БСЭ для достижения конечной концентрации примерно в два раза от 10 до седьмого КОЕ на миллилитр. Вихревая культуральная трубка. Затем с помощью многоканальной пипетки переносят 150 микролитров разведенной бактериальной культуры в лунки биопленочного микротитра планшета в трех экземплярах.
Загрузите 150 микролитров среды TSB в три новые скважины в качестве контроля. Затем инкубируйте планшет микротитра биопленки при температуре 30 градусов Цельсия в течение 24 часов без перемешивания. Очистите и высушите на воздухе части биореактора, прежде чем поместить плоское лезвие внутрь стеклянного стакана объемом один литр, прикрепленного к держателю с помощью магнитной планки.
Поддерживайте установку в вертикальном положении с помощью пластиковой планки, прикрепленной к внутренней стороне крышки биореактора. Используйте отвертку, чтобы разместить купоны или направляющие из нержавеющей стали на полипропиленовых стержнях. Вставляйте купоны или слайды в отверстия в крышке, не помещая их выравнивающие штифты в выемки, позволяющие пару выходить во время стерилизации.
Закройте все вентиляционные отверстия биореактора алюминиевой фольгой и оберните остальное оборудование, а именно трубки размера 18 и трубки размера 16, стеклянный тормоз потока, крышки контейнеров, отвертки, щипцы и фильтры 0,2 микрометра алюминиевой фольгой. Автоклавный биореактор устанавливается в сухой цикл при температуре 121 градус Цельсия в течение 20 минут. Чтобы выполнить первую стадию образования биопленки в биореакторе в периодическом режиме, внутри шкафа биологической безопасности подсоедините один конец трубки размера 18 к выходному патрубку биореактора, а другой конец держите завернутым в алюминиевую фольгу.
Извлеките один купон или держатель слайда из крышки биореактора и поместите его в стерильную 50-миллилитровую пробирку. Затем с помощью серологической пипетки объемом 50 миллилитров наполните стакан биореактора 340 миллилитрами по 300 миллиграммов на миллилитр среды TSB через отверстие, занятое стержнем. Чтобы инокулировать питательную среду в биореакторе, добавьте один миллилитр 10 к восьмому КОЕ на миллилитр бактериального раствора Pseudomonas azotoformans через отверстие с помощью пятимиллилитровой пипетки и поместите стержень обратно в исходное положение.
Расположите стержни, уже помещенные в отверстия крышки, чтобы штифты вошли в соответствующие выемки. Затем поместите бактериальный фильтр продувки воздуха 0,2 микрометра на конец трубки наименьшего диаметра, расположенной на крышке биореактора. Другая трубка того же диаметра остается постоянно закупоренной металлической завинчивающейся крышкой или силиконовой заглушкой, которая плотно закрывается.
Поместите биореактор на 24 часа на нагревательную пластину, установленную при температуре 30 градусов Цельсия, и перемешайте при 130 об/мин. Через 24 часа выполняют вторую стадию формирования биопленки в биореакторе в режиме непрерывного потока. Поместите контейнер, содержащий 18 литров стерильной дистиллированной воды, в шкаф биобезопасности.
Затем добавляют два литра по 1000 миллиграммов на литр питательной среды БСЭ для получения конечной концентрации 100 миллиграммов на литр. Накройте контейнер стерильным колпачком, к которому подсоедините две пробирки. Первый представляет собой силиконовую трубку, закрепленную на интерфейсе колпачка для нагнетания среды.
Вторая, трубка размера 16, соединена с внешним портом, позволяя жидкости течь к биореактору. После подключения трубки размера 16 к концу тормоза потока стекла вставьте последний в самую большую трубку на крышке биореактора другим его концом, а затем установите трубку размера 16 в перистальтический насос. Используйте еще 20-литровый контейнер для сбора сточных вод из биореактора.
Прикрепите конец трубки, соединенной с выходным носиком биореактора, к крышке контейнера для отходов. Вставьте фильтр 0,2 микрометра в трубку, расположенную на крышке этого контейнера. После этого запустите перистальтический насос с расходом 11,3 миллилитра в минуту и оставьте систему работать на 24 часа.
Через 24 часа выключите перистальтический насос и прекратите перемешивание и нагрев биореактора. Чтобы восстановить бактериальную биопленку, промойте купоны или предметные стекла в 40 миллилитрах PBS для уничтожения планктонных бактерий. Затем выпустите их в стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую 40 миллилитров PBS.
После 30 секунд вихря обработайте ультразвуком трубки на частоте 40 килогерц в течение 30 секунд. Повторите это три раза. После этого соберите 40 миллилитров суспензии биопленки в стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров и промойте купоны или предметные стекла двумя стерильными растворами PBS.
Восстановите эту жидкость для полоскания и добавьте ее в уже собранную суспензию биопленки. Выньте микротитровальную пластину при температуре 30 градусов Цельсия. Добавьте 200 микролитров PBS в три лунки 96-луночной микропланшета.
Чтобы промыть биопленки и устранить планктонные бактерии, перенесите крышку микропланшета с биопленками, образовавшимися на колышках, на 96-луночную микропланшет, содержащий PBS, на 10 секунд. Приготовьте дезинфицирующие средства в необходимых концентрациях и добавьте по 200 микролитров каждой концентрации дезинфицирующего средства в лунки новой 96-луночной микротитровальной пластины в трех экземплярах. Перенесите крышку планшета с микротитровальной пленкой на планшет с микротитровальной пленкой 96 лунок, содержащий дезинфицирующие средства, и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение желаемого времени экспозиции.
Затем добавьте 200 микролитров нейтрализующего бульона Дей-Энгли в лунки новой 96-луночной микротитровальной пластины. Перенесите крышку пластины биопленочного микротитра на 96-луночную микротитровальную пластину, содержащую нейтрализующий бульон. Запечатайте микротитровальную пластину парапленкой и поместите ее в ультразвуковой аппарат для ванны с частотой 40 килогерц на 30 минут.
Через 30 минут из первой колонки ультразвуковой пластины перенесите 100 микролитров отделившихся биопленок в первый ряд новой 96-луночной микротитровальной пластины. Затем добавьте 180 микролитров стерильного PBS в 96-луночную пластину, за исключением первого ряда. Далее переносят 20 микролитров раствора биопленки из первого ряда в лунки во втором ряду, содержащие 180 микролитров ПБС, чтобы добиться разведения 10 в минус один.
Затем переложите 20 микролитров со второго ряда в лунки в следующем ряду, чтобы добиться разведения 10 до минус двух. Повторите это, чтобы получить разбавление от 10 до минус пяти и от 10 до минус семи. Инокулируйте 100 микролитров желаемого разведения на TSA и инкубируйте планшеты в соответствии с параметрами роста бактерии.
Сформируйте биопленки Pseudomonas azotoformans PFLA 1 на купонах в биореакторе, удалите стержень, удерживающий купоны, и промойте стержень внутри конической трубки, содержащей 30 миллилитров PBS, для удаления планктонных клеток. Опустите каждый купон в стерильную коническую трубку объемом 50 миллилитров с помощью отвертки. Затем добавьте четыре миллилитра соответствующего раствора органической пероксикислоты или PBS для контроля.
После пяти минут инкубации добавьте 36 миллилитров нейтрализующего отвара Дей-Энгли. После вихряния конической трубки в течение 30 секунд обрабатывайте их ультразвуком на частоте 40 килогерц в течение 30 секунд. Повторите процесс три раза, чтобы получить суспензию биопленки.
Повторите ту же процедуру с другими палочками, приготовьте серийные заблуждения суспензии биопленки и нанесите суспензию на среду TSA, как описано ранее. Анализ SCM показал наличие биопленки Pseudomonas azotoformans PFL1A на колышках микропланшетов биопленки. Биопленка Pseudomonas azotoformans PFL1A, сформированная на предметном стекле из нержавеющей стали с помощью биореактора, оказалась очень плотной и демонстрировала морфологические характеристики зрелой трехмерной биопленки.
Результаты бактериальных подсчетов биопленок, разработанных этим изолятом в динамической системе, показали значительную плотность клеток, соответствующую 8,74 log КОЕ на квадратный сантиметр в питательной среде БСЭ и 7,86 log КОЕ сантиметр квадратный сантиметр в стерильном обезжиренном молоке. Результаты, полученные с изолятом B.vesicularis, показали, что увеличение концентрации питательных веществ со 100 до 900 миллиграммов на литр привело к увеличению количества бактерий в биопленках с 6,11 до 8,71 log КОЕ сантиметр квадратный. Кроме того, значительный рост биопленки наблюдался при снижении скорости потока до 6,0 миллилитров в минуту, что указывает на то, что определенные факторы могут влиять на образование биопленки в биореакторе.
Ни одна из биопленок не содержала обнаруживаемых жизнеспособных клеток при пятиминутном контакте в 500 частей на миллион с органическими пероксикислотами и 100 000 частей на миллион с концентрациями перекиси водорода дезинфицирующих средств, обычно применяемых на молочных заводах. SCM показал трехмерную структуру необработанной минимальной концентрации эрадикации биопленки или биопленок MBEC, в то время как обработанные биопленки MBEC потеряли свою трехмерную конформацию. Очень важно оставаться в стерильном состоянии при выполнении этого протокола.
Кроме того, пользователь должен помнить, что сгенерированный результат связан с уникальным изолятом и дезинфицирующим средством. Сочетание дезинфицирующего средства с механической вибрацией, ультразвуком или ферментативной обработкой может быть оценено для повышения эффективности эрадикации биопленки. Этот подход, использующий статические и динамические методы формирования биопленок, проложил путь для исследователей к скринингу и изучению новых составов антибиопленок для лучшего контроля биопленок в различных секторах.
