Organik Peroksiasitlerin Süt Biyofilmlerinin Eradikasyonunda Etkinliğinin Statik ve Dinamik Yöntemleri Birleştiren Bir Yaklaşım Kullanılarak Değerlendirilmesi

Biyofilm oluşturan mikroorganizma, süt endüstrisi de dahil olmak üzere gıda endüstrisinde önemli bir konudur. Ürünlerin kalitesi üzerindeki olumsuz etkileri nedeniyle, biyofilm kontrol stratejilerinin geliştirilmesi önemlidir. Bu yaklaşım, statik yüksek verimli bir tarama yöntemini ve yerinde koşulları taklit eden dinamik bir yöntemi birleştirir.

Bu iki yöntem, dezenfektanların biyofilmlere karşı etkinliğini incelemek için tamamlayıcı niteliktedir. Bu yaklaşım, gıda, tıbbi veya çevresel sektörlerdeki biyofilmleri kontrol etmek için yeni biyolojik veya kimyasal formülasyonları test etmek için kullanılabilir. Pseudomonas azotoformans bakteri kültürü tüplerini vorteksleyerek başlayın.

Aseptik olarak bakteri kültürünün 100 mikrolitresini 10 mililitre steril triptik soya suyuna veya TSB ortamına aktararak mililitre başına yaklaşık iki kez 10 ila yedinci CFU'nun nihai konsantrasyonunu elde edin. Kültür tüpünü vorteksleyin. Daha sonra çok kanallı bir pipet kullanarak, seyreltilmiş bakteri kültürünün 150 mikrolitresini biyofilm mikrotitre plakası kuyucuklarına üçlü olarak aktarın.

Kontrol olarak 150 mikrolitre TSB ortamını üç yeni kuyuya yükleyin. Daha sonra, biyofilm mikrotitre plakasını ajitasyon olmadan 24 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Düz bıçağı tutucuya manyetik bir çubukla tutturulmuş bir litrelik cam kabın içine yerleştirmeden önce biyoreaktörün parçalarını temizleyin ve havayla kurulayın.

Biyoreaktör kapağının iç tarafına tutturulmuş plastik çubuğu kullanarak kurulumu dik tutun. Paslanmaz çelik kuponları veya kızakları polipropilen çubuklarına yerleştirmek için tornavidayı kullanın. Kuponları veya slaytları, hizalama pimlerini çentiklere yerleştirmeden kapaktaki deliklere yerleştirin ve sterilizasyon sırasında buharın kaçmasına izin verin.

Tüm biyoreaktör havalandırma deliklerini alüminyum folyo ile örtün ve ekipmanın geri kalanını, yani 18 boru boyutu ve 16 boru boyutu, cam akış freni, konteyner kapakları, tornavidalar, forsepsler ve 0.2 mikrometre filtreleri alüminyum folyo ile sarın. Biyoreaktörü 20 dakika boyunca 121 santigrat derecede kuru bir döngüde otoklav yapın. Biyoreaktördeki biyofilm oluşumunun ilk adımını parti modunda, biyolojik bir güvenlik kabini içinde gerçekleştirmek için, 18 boyutlu borunun bir ucunu biyoreaktörün çıkış ağzına bağlayın ve diğer ucunu alüminyum folyoya sarılı tutun.

Biyoreaktör kapağından bir kupon veya sürgü tutucuyu çıkarın ve steril 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Daha sonra 50 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, biyoreaktör kabını, çubuğun işgal ettiği delikten mililitre TSB ortamı başına 340 mililitre 300 miligram ile doldurun. Biyoreaktördeki kültür ortamını aşılamak için, beş mililitrelik bir pipet kullanarak delikten geçen mililitre başına sekizinci CFU'ya 10 mililitrelik bir mililitre Pseudomonas azotoformans bakteri çözeltisi ekleyin ve çubuğu orijinal konumuna geri yerleştirin.

Pimlerin ilgili çentiklere sığması için kapak deliklerine önceden yerleştirilmiş çubukları konumlandırın. Ardından, biyoreaktörün kapağında bulunan en küçük çaplı tüpün sonuna 0,2 mikrometrelik bir bakteriyel hava tahliye filtresi yerleştirin. Aynı çaptaki diğer boru, metal vidalı bir kapak veya sıkıca kapanan silikon bir fiş ile kalıcı olarak takılı kalır.

Biyoreaktörü 24 saat boyunca 30 santigrat dereceye ayarlanmış ısıtma plakasının üzerine yerleştirin ve 130 RPM'de karıştırın. 24 saat sonra, biyoreaktördeki biyofilm oluşumunun ikinci adımını sürekli akış modunda gerçekleştirin. Biyogüvenlik kabinine 18 litre steril damıtılmış su içeren bir damacana yerleştirin.

Daha sonra, litre başına 100 miligramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için litre başına iki litre 1000 miligram TSB kültür ortamı ekleyin. Kabı, iki tüpün bağlı olduğu steril kapağıyla örtün. Birincisi, ortamı pompalamak için kapağın arayüzüne sabitlenmiş silikon bir tüptür.

İkincisi, 16 boru büyüklüğündeki boru, sıvının biyoreaktöre doğru akmasına izin veren harici porta bağlanır. 16 boyutlu boruyu cam akış freninin ekstremitesine bağladıktan sonra, ikincisini biyoreaktörün kapağındaki en büyük boruya diğer ucundan yerleştirin ve ardından 16 boyutlu boruyu peristaltik pompaya takın. Atık suyu biyoreaktörden toplamak için başka bir 20 litrelik damacana kullanın.

Biyoreaktör çıkış ağzına bağlı tüpün ucunu atık kabının kapağına takın. Bu kabın kapağında bulunan tüpe 0,2 mikrometrelik bir filtre yerleştirin. İşiniz bittiğinde, peristaltik pompayı dakikada 11,3 mililitre akış hızında çalıştırın ve sistemi 24 saat çalışır durumda bırakın.

24 saat sonra, peristaltik pompayı kapatın ve biyoreaktörü karıştırmayı ve ısıtmayı bırakın. Bakteriyel biyofilmi geri kazanmak için, planktonik bakterileri ortadan kaldırmak için kuponları veya slaytları 40 mililitre PBS'de durulayın. Daha sonra bunları 40 mililitre PBS içeren steril 50 mililitrelik konik bir tüpe bırakın.

30 saniyelik girdaptan sonra, tüpleri 30 saniye boyunca 40 kilohertz'de sonikleştirin. Bunu üç kez tekrarlayın. İşiniz bittiğinde, 40 mililitre biyofilm süspansiyonunu steril 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve kuponları veya slaytları iki steril PBS çözeltisi ile durulayın.

Bu durulama sıvısını geri kazanın ve önceden toplanan biyofilm süspansiyonuna ekleyin. Mikrotitre plakasını 30 santigrat dereceden çıkarın. 96 delikli bir mikro plakanın üç kuyucuğuna 200 mikrolitre PBS ekleyin.

Biyofilmleri yıkamak ve planktonik bakterileri ortadan kaldırmak için, mandallar üzerinde oluşturulan biyofilmlerle biyofilm mikroplakasının kapağını, PBS'yi içeren 96 delikli mikro plakaya 10 saniye boyunca aktarın. Dezenfektanları gerekli konsantrasyonlarda hazırlayın ve her dezenfektan konsantrasyonundan 200 mikrolitreyi üçlü olarak yeni bir 96 delikli mikrotitre plakasının kuyularına ekleyin. Biyofilm mikrotitre plakasının kapağını, dezenfektanları içeren 96 kuyucuklu mikrotitre plakasına aktarın ve plakayı istenen maruz kalma süresi için oda sıcaklığında inkübe edin.

Daha sonra, yeni bir 96 delikli mikrotitre plakasının kuyularına 200 mikrolitre Dey-Engley nötrleştirici et suyu ekleyin. Biyofilm mikrotitre plakasının kapağını, nötrleştirici suyu içeren 96 delikli mikrotitre plakasına aktarın. Mikrotitre plakasını parafilm ile kapatın ve 30 dakika boyunca 40 kilohertz'de banyo sonikatörüne yerleştirin.

30 dakika sonra, sonikleştirilmiş plakanın ilk sütunundan, 100 mikrolitre müstakil biyofilmi yeni bir 96 kuyucuklu mikrotitre plakasının ilk sırasına aktarın. Ardından, ilk sıra hariç 96 delikli bir plakaya 180 mikrolitre steril PBS ekleyin. Daha sonra, 10'dan eksi olana seyreltmeyi sağlamak için ilk sıradan 20 mikrolitre biyofilm çözeltisini 180 mikrolitre PBS içeren ikinci sıradaki kuyucuklara aktarın.

Ardından, 10'un eksi ikiye seyreltilmesini sağlamak için ikinci sıradan bir sonraki sıradaki kuyucuklara 20 mikrolitre aktarın. 10 ila eksi beş ve 10 ila eksi yedi arasında seyreltme elde etmek için bunu tekrarlayın. TSA üzerinde istenen seyreltmenin 100 mikrolitresini aşılayın ve plakaları bakterinin büyüme parametrelerine göre inkübe edin.

Biyoreaktördeki kuponlar üzerinde Pseudomonas azotoformans PFLA 1 biyofilmlerini oluşturun, kuponları tutan çubuğu çıkarın ve planktonik hücreleri çıkarmak için çubuğu 30 mililitre PBS içeren konik bir tüp içinde durulayın. Her kuponu bir tornavida kullanarak steril 50 mililitrelik konik bir tüpe bırakın. Daha sonra kontrol için dört mililitre uygun organik peroksiasit çözeltisi veya PBS ekleyin.

Beş dakikalık inkübasyondan sonra, 36 mililitre Dey-Engley nötrleştirici et suyu ekleyin. Konik tüpü 30 saniye boyunca vorteksledikten sonra, 30 saniye boyunca 40 kilohertz'de sonikleştirin. Biyofilm süspansiyonunu elde etmek için işlemi üç kez tekrarlayın.

Aynı prosedürü diğer çubuklarla tekrarlayın, biyofilm süspansiyonunun seri sanrılarını hazırlayın ve süspansiyonu daha önce açıklandığı gibi TSA ortamına yerleştirin. SCM analizi, biyofilm mikroplaka mandalları üzerinde Pseudomonas azotoformans PFL1A tarafından biyofilmin varlığını göstermiştir. Bir biyoreaktör kullanılarak paslanmaz çelik bir slayt üzerinde oluşturulan Pseudomonas azotoformans PFL1A biyofilmi çok yoğun görünüyordu ve olgun bir üç boyutlu biyofilmin morfolojik özelliklerini sergiledi.

Dinamik sistemde bu izolatın geliştirdiği biyofilmlerin bakteri sayımlarının sonuçları, TSB kültür ortamında santimetre kare başına 8.74 log CFU ve steril yağsız sütte 7.86 log CFU santimetre kareye karşılık gelen önemli hücre yoğunluklarını göstermiştir. B.vesicularis izolatı ile elde edilen sonuçlar, besin konsantrasyonundaki litre başına 100 ila 900 miligram arasındaki artışın, biyofilmlerin bakteriyel sayısında 6.11'den 8.71 log CFU santimetre kareye bir artışa neden olduğunu göstermiştir. Ayrıca, akış hızı dakikada 6.0 mililitreye düşürüldüğünde önemli biyofilm büyümesi gözlenmiştir, bu da bazı faktörlerin biyoreaktördeki biyofilm oluşumunu etkileyebileceğini göstermektedir.

Biyofilmlerin hiçbiri, organik peroksiasitlerle milyonda 500 parça ve genellikle süt tesislerinde uygulanan dezenfektanların hidrojen peroksit konsantrasyonları ile milyonda 100.000 parça temas süresinde beş dakikalık temas süresinde tespit edilebilir canlı hücreler içermedi. SCM, işlenmemiş minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonunun veya MBEC biyofilmlerinin üç boyutlu yapısını gösterirken, işlenmiş MBEC biyofilmleri üç boyutlu konformasyonlarını kaybetti. Bu protokolü uygularken steril durumda kalmak esastır.

Ayrıca, kullanıcı üretilen sonucun benzersiz bir izolat ve dezenfektan ile ilişkili olduğunu hatırlamalıdır. Dezenfektanı mekanik titreşim, ultrason veya enzimatik tedavilerle birleştirmek, biyofilm eradikasyonunun etkinliğini artırmak için değerlendirilebilir. Biyofilm oluşturmak için statik ve dinamik yöntemler kullanan bu yaklaşım, araştırmacıların çeşitli sektörlerdeki biyofilmleri daha iyi kontrol etmek için yeni anti-biyofilm formülasyonunu taramalarının ve incelemelerinin yolunu açmıştır.