抗原捕获酶联免疫吸附测定用于肺炎支原体特异性检测

至于所有支原体患者，由于交叉反应，他们对肺炎支原体的诊断具有挑战性。我们提出的ELISA基于使用吸附技术选择性去除非特异性肺炎支原体抗原。本视频中描述的内部抗原捕获 ELISA 保证了高广的特异性。

实际上，它已被证明是准确诊断肺炎支原体感染的可靠筛查测试。展示ELISA前步骤的将是博士生Imen Chniba。ELISA步骤将是Nadine Khadraoui，我们实验室的技术员。

要开始抗原吸附程序，将12种异源细菌抗原拉入微量离心管中，并调整对应于要吸附的抗血清一半的蛋白质浓度。接下来，将抗原混合物在14， 000 G下在4摄氏度下离心10分钟以收集沉淀。然后，用纯化的多克隆抗肺炎支原体IgG重新悬浮沉淀，并在37摄氏度下缓慢搅拌孵育两个小时。

在孵育结束时，在4摄氏度下再次以14， 000G离心悬浮液10分钟，并回收对应于特定多克隆肺炎支原体抗血清的上清液。要用捕获抗体包被 96 孔 ELISA 板，请将抗体稀释至 pH 9.6 下每毫升 10 μg 和 0.1 摩尔碳酸氢盐缓冲液。然后，向微孔板的每个孔中加入100微升稀释的抗体，并在4摄氏度下孵育过夜。

第二天，除去涂层溶液并用洗涤缓冲液洗涤板五次。接下来，通过向每个孔中添加 100 微升封闭溶液来封闭涂层孔的未结合表面。在室温下孵育板一小时后，用移液管除去封闭溶液并如前所述洗涤板。

以每孔10纳克的浓度加入等量的肺炎支原体全蛋白，并使抗原抗体反应在室温下发生两小时。孵育后，去除多余的抗原并如图所示洗涤平板。接下来，稀释人血清检测样品并参考阳性和阴性血清对照。

然后，将100微升稀释的测试样品和对照添加到适当的孔中并重复。将既不含抗原也不含有血清的孔标记为空白。在室温下孵育板90分钟后，除去血清溶液并用洗涤缓冲液洗涤板五次。

将100微升适当的稀释酶偶联检测抗体移液到每个孔中，并在黑暗中在37摄氏度下孵育一小时。取出未结合的检测体并清洗板后，加入100微升TMB色原溶液以可视化抗原 - 抗体结合。让板在室温下显影 30 分钟。

然后，通过加入100微升7.5%硫酸来停止反应。最后，使用酶标仪读取450纳米处的吸光度，并根据阳性指数的计算对结果进行排序。肺炎支原体非吸附多克隆抗血清和异源细菌抗原之间的免疫印迹分析显示交叉反应性，但强度不同。

例如，败血症支原体和拟支原体抗原尽管是禽支原体，但表现出最强的反应性。相比之下，解脲支原体的两种人类临床分离株均未显示任何反应。然而，剩余的人生殖器支原体物种的抗原和其他细菌抗原与抗血清产生了相当大的交叉反应。

免疫印迹分析证实了肺炎支原体多克隆抗血清吸附异源细菌抗原的效率。吸附程序消除了所有交叉反应，从而使肺炎支原体抗血清对所有后续血清学和免疫印迹测试具有特异性。此外，使用本研究中开发的抗原捕获ELISA测试的人血清集被证明对肺炎支原体IgG呈阳性，具有良好的特异性。

这种ELISA的特殊性主要由吸附技术保证，因为仔细执行这一关键步骤并重复至少两次或三次是最基本的。该技术的原理可用于诊断其他支原体物种或其他细菌。然而，选择用于吸附的细菌抗原应该是无关紧要和充分的。