Wie bei allen Mykoplasmen-Patienten ist die Diagnose von Mycoplasma pneumoniae aufgrund von Kreuzreaktionen eine Herausforderung. Unser vorgeschlagener ELISA basiert auf der selektiven Depletion von unspezifischen Mycoplasm pneumoniae-Antigenen unter Verwendung einer Adsorptionstechnik. Der in diesem Video beschriebene hauseigene Antigen-Capture-ELISA garantiert eine hohe räumliche Spezifität.
Und tatsächlich hat es sich als zuverlässiger Screening-Test für eine genaue Diagnose einer Mycoplasm pneumoniae-Infektion erwiesen. Imen Chniba, eine Doktorandin, demonstriert die Schritte vor dem ELISA. Und die ELISA-Schritte wird Nadine Khadraoui, eine Technikerin aus unserem Labor, sein.
Um die Antigenadsorption zu beginnen, ziehen Sie die 12 heterologen bakteriellen Antigene in ein Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie die Proteinkonzentration entsprechend der Hälfte des zu adsorbierenden Antiserums ein. Als nächstes zentrifugieren Sie das Antigengemisch bei 14.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um das Pellet zu sammeln. Dann wird das Pellet mit dem gereinigten polyklonalen Anti-Mycoplasma pneumoniae IgG erneut suspendiert und zwei Stunden bei 37 Grad Celsius unter langsamer Bewegung inkubiert.
Am Ende der Inkubation wird die Suspension erneut bei 14.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand entsprechend dem spezifischen polyklonalen Mycoplasma pneumoniae-Antiserum gewonnen. Um eine 96-Well-ELISA-Platte mit einem Fänger-Antikörper zu beschichten, verdünnen Sie den Antikörper auf 10 Mikrogramm pro Milliliter und 0,1 molaren Karbonatbicarbonat-Puffer bei pH 9,6. Dann geben Sie 100 Mikroliter des verdünnten Antikörpers in jede Vertiefung der Mikroplatte und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius.
Entfernen Sie am nächsten Tag die Beschichtungslösung und waschen Sie die Platte fünfmal mit dem Waschpuffer. Als nächstes blockieren Sie die ungebundenen Oberflächen der beschichteten Vertiefungen, indem Sie jedem Vertiefung 100 Mikroliter der Blockierungslösung hinzufügen. Nachdem Sie die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert haben, entfernen Sie die Blocklösung mit einer Pipette und waschen Sie die Platte wie zuvor gezeigt.
Fügen Sie eine gleiche Menge Mycoplasma pneumoniae ganzer Proteine in einer Konzentration von 10 Nanogramm pro Vertiefung hinzu und lassen Sie die Antigen-Antikörper-Reaktion zwei Stunden lang bei Raumtemperatur stattfinden. Entfernen Sie nach der Inkubation das überschüssige Antigen und waschen Sie die Platte wie gezeigt. Als nächstes verdünnen Sie die menschlichen Serumtestproben und verweisen Sie auf positive und negative Serumkontrollen.
Dann werden 100 Mikroliter der verdünnten Testproben und Kontrollen in die entsprechenden Vertiefungen und Duplikate gegeben. Markieren Sie die Vertiefungen, die weder Antigen noch Seren enthalten, als leer. Nachdem Sie die Platte 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert haben, entfernen Sie die Serumlösung und waschen Sie die Platte fünfmal mit dem Waschpuffer.
100 Mikroliter des entsprechenden verdünnten Enzyms konjugierte Nachweisantikörper in jede Vertiefung pipettieren und eine Stunde bei 37 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren. Nach dem Entfernen der ungebundenen Nachweiskörper und dem Waschen der Platte fügen Sie 100 Mikroliter TMB-Chromogenlösung hinzu, um die Antigen-Antikörper-Bindung zu visualisieren. Lassen Sie die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur entwickeln.
Stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie 100 Mikroliter 7,5% Schwefelsäure hinzufügen. Lesen Sie schließlich die Absorption bei 450 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader ab und sortieren Sie die Ergebnisse basierend auf der Berechnung des Positivitätsindex. Die Immunoblot-Analyse zwischen dem nicht-adsorbierten polyklonalen Antiserum Mycoplasma pneumoniae und heterologen bakteriellen Antigenen ergab eine Kreuzreaktivität, jedoch mit unterschiedlicher Intensität.
Zum Beispiel zeigten die Antigene Mycoplasma gallisepticum und Mycoplasma imitans die stärkste Reaktivität, obwohl es sich um Vogelmykoplasmen handelte. Im Gegensatz dazu zeigte keines der beiden humanen klinischen Isolate von Ureaplasma urealyticum eine Reaktion. Antigene der verbliebenen humanen Genitalmykoplasmen-Spezies und andere bakterielle Antigene führten jedoch zu erheblichen Kreuzreaktionen mit dem Antiserum.
Die Immunoblot-Analyse bestätigte die Wirksamkeit der polyklonalen Antiserum-Adsorption von Mycoplasma pneumoniae gegen die heterologen bakteriellen Antigene. Das Adsorptionsverfahren eliminierte alle Kreuzreaktionen, so dass das Antiserum Mycoplasma pneumoniae für alle nachfolgenden serologischen und Immunblotting-Tests spezifisch wurde. Darüber hinaus erwies sich der Satz humaner Seren, die mit dem in dieser Studie entwickelten Antigen-Capture-ELISA getestet wurden, als positiv für Mycoplasma pneumoniae IgG mit guter Spezifität.
Die Spezifität dieses ELISA wird hauptsächlich durch die Adsorptionstechnik gewährleistet, da es von grundlegender Bedeutung ist, diesen kritischen Schritt sorgfältig durchzuführen und mindestens zwei- oder dreimal zu wiederholen. Das Prinzip dieser Technik kann angewendet werden, um andere Mykoplasmenarten oder andere Bakterien im Allgemeinen zu diagnostizieren. Die Auswahl der bakteriellen Antigene für die Adsorption sollte jedoch irrelevant und angemessen sein.
