Tüm mikoplazma hastalarına gelince, çapraz reaksiyonlar nedeniyle Mikoplazma pnömonisi tanısı zordur. Önerdiğimiz ELISA, bir adsorpsiyon tekniği kullanılarak spesifik olmayan Mikoplazma pnömoni antijenlerinin seçici tükenmesine dayanmaktadır. Bu videoda açıklanan şirket içi antijen yakalama ELISA, yüksek ferah özgüllüğü garanti eder.
Ve aslında, Mikoplazma pnömoni enfeksiyonunun doğru teşhisi için güvenilir bir taramalı test olduğu kanıtlanmıştır. ELISA öncesi adımları gösteren, doktora öğrencisi Imen Chniba olacak. Ve ELISA adımları, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Nadine Khadraoui olacak.
Antijen adsorpsiyon prosedürüne başlamak için, 12 heterolog bakteriyel antijeni bir mikrosantrifüj tüpüne çekin ve adsorbe edilecek antiserumun yarısına karşılık gelen protein konsantrasyonunu ayarlayın. Daha sonra, peleti toplamak için antijen karışımını 14.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin. Daha sonra, peleti saflaştırılmış poliklonal anti-Mycoplasma pneumoniae IgG ile tekrar askıya alın ve yavaş ajitasyonla 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin.
Kuluçka sonunda, süspansiyonu dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 14.000 G'de tekrar santrifüj edin ve spesifik poliklonal Mycoplasma pneumoniae antiserumuna karşılık gelen süpernatantı geri kazanın. 96 kuyucuklu bir ELISA plakasını yakalama antikoru ile kaplamak için, antikoru mililitre başına 10 mikrograma ve pH 9.6'da 0.1 molar karbonat bikarbonat tamponuna seyreltin. Daha sonra, mikroplakanın her bir kuyucuğuna seyreltilmiş antikorun 100 mikrolitresini ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, kaplama çözeltisini çıkarın ve plakayı yıkama tamponu ile beş kez yıkayın. Daha sonra, kaplanmış kuyucukların bağlanmamış yüzeylerini, her bir kuyucuğa 100 mikrolitre blokaj çözeltisi ekleyerek bloke edin. Plakayı oda sıcaklığında bir saatten inkübe ettikten sonra, bloke edici çözeltiyi bir pipetle çıkarın ve plakayı daha önce gösterildiği gibi yıkayın.
Kuyucuk başına 10 nanogram konsantrasyonda eşit miktarda Mycoplasma pneumoniae bütün proteinleri ekleyin ve antijen-antikor reaksiyonunun oda sıcaklığında iki saat boyunca gerçekleşmesine izin verin. Kuluçkayı takiben, fazla antijeni çıkarın ve plakayı gösterildiği gibi yıkayın. Daha sonra, insan serum test örneklerini seyreltin ve pozitif ve negatif serum kontrollerine referans verin.
Daha sonra, seyreltilmiş test numunelerinden 100 mikrolitre ekleyin ve uygun kuyucuklara ve kopyalara kontroller yapın. Ne antijen ne de serum içeren kuyucukları boş olarak işaretleyin. Plakayı oda sıcaklığında 90 dakika inkübe ettikten sonra, serum çözeltisini çıkarın ve plakayı yıkama tamponu ile beş kez yıkayın.
Pipet, uygun seyreltilmiş enzimin 100 mikrolitresi, her bir kuyucuğa konjuge tespit antikorlarını konjuge eder ve karanlıkta 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe eder. Bağlanmamış algılama gövdelerini çıkardıktan ve plakayı yıkadıktan sonra, antijen-antikor bağlanmasını görselleştirmek için 100 mikrolitre TMB Kromojen çözeltisi ekleyin. Plakanın oda sıcaklığında 30 dakika boyunca gelişmesine izin verin.
Ardından, 100 mikrolitre% 7.5 sülfürik asit ekleyerek reaksiyonu durdurun. Son olarak, bir mikroplaka okuyucu kullanarak 450 nanometredeki absorbansı okuyun ve sonuçları pozitiflik indeksinin hesaplanmasına göre sıralayın. Mycoplasma pneumoniae non adsorbe poliklonal antiserum ve heterolog bakteriyel antijenler arasındaki immünoblot analizinde çapraz reaktivite saptandı, ancak değişen yoğunlukta.
Örneğin, Mycoplasma gallisepticum ve Mycoplasma imitans antijenleri, kuş mikoplazmaları olmasına rağmen en güçlü reaktiviteyi göstermiştir. Buna karşılık, Ureaplasma urealyticum'un iki insan klinik izolatından hiçbiri herhangi bir reaksiyon göstermedi. Bununla birlikte, kalan insan genital mikoplazma türlerinin ve diğer bakteriyel antijenlerin antijenleri, antiserum ile önemli çapraz reaksiyonlar sağlamıştır.
İmmünoblot analizi, Mycoplasma pneumoniae poliklonal antiserum adsorpsiyonunun heterolog bakteriyel antijenlere karşı etkinliğini doğruladı. Adsorpsiyon prosedürü tüm çapraz reaksiyonları ortadan kaldırdı, böylece Mycoplasma pneumoniae antiserumunu sonraki tüm serolojik ve immünoblotlama testleri için spesifik hale getirdi. Ayrıca, bu çalışmada geliştirilen antijen yakalama ELISA kullanılarak test edilen insan serumları seti, iyi bir özgüllüğe sahip Mycoplasma pneumoniae IgG için pozitif olduğunu kanıtladı.
Bu ELISA'nın özgüllüğü esas olarak adsorpsiyon tekniği ile sigortalanır, çünkü bu kritik adımı dikkatli bir şekilde gerçekleştirmek ve en az iki veya üç kez tekrarlamak ilkeldir. Bu tekniğin prensibi, diğer mikoplazma türlerini veya genel olarak diğer bakterileri teşhis etmek için uygulanabilir. Bununla birlikte, adsorpsiyon için bakteriyel antijenlerin seçimi alakasız ve yeterli olmalıdır.
