באשר לכל החולים של מיקופלסמה, האבחנה שלהם של דלקת ריאות Mycoplasm היא מאתגרת בגלל תגובות צולבות. ELISA המוצעת שלנו מבוססת על דלדול סלקטיבי של אנטיגנים לא ספציפיים של דלקת ריאות Mycoplasm באמצעות טכניקת ספיחה. לכידת האנטיגן הפנימית ELISA המתוארת בסרטון זה מבטיחה ספציפיות מרווחת גבוהה.
ובעצם, זה הוכיח להיות בדיקה מסוקרת אמינה לאבחנה מדויקת של זיהום דלקת ריאות מיקופלסמה. מי שתדגים את הצעדים שלפני ELISA תהיה אימאן צ'נבה, סטודנטית לדוקטורט. ומדרגות ELISA תהיה נדין ח'דראווי, טכנאית מהמעבדה שלנו.
כדי להתחיל בהליך ספיחת האנטיגן, משוך את 12 האנטיגנים החיידקיים ההטרולוגיים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה והתאם את ריכוז החלבון המתאים למחצית מהאנטי-סרום לספיחה. לאחר מכן, צנטריפוגה תערובת אנטיגן ב 14, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את הכדור. לאחר מכן, להשעות מחדש את הכדור עם פוליקלונלי מטוהר אנטי Mycoplasma דלקת ריאות IgG ו דגירה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה איטית.
בסוף הדגירה, צנטריפוגה ההשעיה שוב ב 14, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס לשחזר את supernatant המתאים פוליקלונלי ספציפי Mycoplasma דלקת ריאות antiserum. כדי לצפות צלחת ELISA בעלת 96 בארות עם נוגדן לכידה, דילל את הנוגדן ל-10 מיקרוגרם למיליליטר ו-0.1 בופר ביקרבונט פחמתי טוחן ב-pH 9.6. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של הנוגדן המדולל לכל באר של המיקרופלטה ודגרה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת, הסר את תמיסת הציפוי ושטוף את הצלחת חמש פעמים עם חיץ הכביסה. לאחר מכן, חסום את המשטחים הלא מאוגדים של הבארות המצופות על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של תמיסת החסימה לכל באר. לאחר דגירה של הצלחת משעה בטמפרטורת החדר, הסר את התמיסה החוסמת עם פיפטה ושטוף את הצלחת כפי שהודגם קודם לכן.
הוסיפו כמות שווה של חלבונים שלמים של Mycoplasma pneumoniae בריכוז של 10 ננוגרם לכל באר ואפשרו לתגובת האנטיגן-נוגדנים להתרחש במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הסר את עודפי האנטיגן ושטוף את הצלחת כפי שהודגם. לאחר מכן, יש לדלל את דגימות בדיקת הסרום האנושיות ולהתייחס לבקרות סרום חיוביות ושליליות.
לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטרים של דגימות הבדיקה המדוללות והבקרות לתוך הבארות והכפילויות המתאימות. סמן את הבארות שאינן מכילות לא אנטיגן ולא סרה כריקות. לאחר דגירה של הצלחת במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר, הסר את תמיסת הסרום ושטוף את הצלחת חמש פעמים עם חיץ הכביסה.
פיפטה 100 מיקרוליטרים של האנזים המדולל המתאים מצומדים נוגדני זיהוי לכל באר ודגרה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר הסרת גופי הזיהוי הלא מאוגדים ושטיפת הצלחת, הוסף 100 מיקרוליטרים של תמיסת TMB Chromogen כדי לדמיין את קשירת נוגדן האנטיגן. תנו לצלחת להתפתח במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, לעצור את התגובה על ידי הוספת 100 microliters של 7.5% חומצה גופרתית. לבסוף, קרא את הספיגה ב 450 ננומטר באמצעות קורא microplate ולמיין את התוצאות על סמך חישוב מדד החיוביות. ניתוח אימונובלוט בין אנטיסרום פוליקלונלי ללא ספיחה לבין אנטיגנים חיידקיים הטרולוגיים גילה תגובתיות צולבת אך בעוצמה משתנה.
לדוגמה, מיקופלסמה גליספטיקום ומיקופלסמה אימיטנס אנטיגנים הציגו את התגובה החזקה ביותר למרות היותם מיקופלסמות של עופות. לעומת זאת, אף אחד משני המבודדים הקליניים האנושיים של אוריפלסמה אוריאליטיקום לא הראה תגובה כלשהי. עם זאת, אנטיגנים של מיני מיקופלסמה באברי המין האנושיים הנותרים ואנטיגנים חיידקיים אחרים הניבו תגובות צולבות ניכרות עם האנטי-סרום.
ניתוח אימונובלוט אישר את היעילות של ספיחת האנטי-סרום הפוליקלונלית של Mycoplasma pneumonia נגד האנטיגנים החיידקיים ההטרולוגיים. הליך ספיחה ביטל את כל התגובות הצולבות, ובכך הפך את Mycoplasma pneumoniae antiserum ספציפי עבור כל הבדיקות הסרולוגיות הבאות ואת immunoblotting בדיקות. יתר על כן, קבוצה של sera אנושי נבדק באמצעות לכידת אנטיגן ELISA שפותחה במחקר זה הוכיח חיובי עבור Mycoplasma דלקת ריאות IgG עם ספציפיות טובה.
הספציפיות של ELISA זה מבוטחת בעיקר על ידי טכניקת ספיחה, שכן זה ראשוני לבצע את הצעד הקריטי הזה בזהירות ולחזור עליו לפחות פעמיים או שלוש פעמים. העיקרון של טכניקה זו יכול להיות מיושם כדי לאבחן מינים אחרים mycoplasma או חיידקים אחרים בכלל. עם זאת, הבחירה של אנטיגנים חיידקיים עבור ספיחה צריך להיות לא רלוונטי ומספיק.
