该协议可以为有效鉴定铁线莲及其掺杂物的真伪材料提供新的策略。该方法可用于药材质量研究，为研究其他中药材质量标准提供参考。要开始样品制备，请将原材料通过具有适当内径的尼龙网，将其研磨至均匀的粒径。
将准确称取2克磨碎的原料转移到带塞的50毫升锥形烧瓶中，然后向烧瓶中加入50毫升甲醇。将塞子放在烧瓶上，以600瓦和40千赫兹的超声波加热30分钟。在孵育结束时，通过滤纸过滤药提取物溶液。
过滤后，将4毫升含有药用提取物的甲醇溶液转移到10毫升容量瓶中。然后加入六毫升水并混合溶液。让溶液沉淀 10 分钟。
用于样品的HPLC分析。首先制备流动相，并按照手稿中所述设置HPLC梯度程序。通过0.45微米微孔滤膜过滤样品并进行HPLC分析。
对于每个样品，每天执行六次分析。为了评估样品溶液的稳定性，请在制备后分析在室温下储存0、2、4、6、8、12和24小时的相同样品溶液。对同一样品进行六次重复，并在HPLC中检测其指纹。
将相关数据导入名为《中药色谱指纹相似度评价系统》或SESCF TCM 2012版的软件。将10批次正宗川木通样品和5批次掺杂物的保留时间和峰面积导入SESCF中药进行分析。在主菜单中，点击设置参考光谱，进入参数设置窗口，将川木桐正宗物种的参考色谱指纹图谱设置为参考。
接下来，将控制频谱生成方法设置为时间窗口宽度为 0.5 的中位数方法。然后，单击主菜单中的多点校准，选择峰，然后选择峰匹配选项作为标记峰。最后，点击计算相似度，基于川木通参比色谱图谱对样品进行相似性分析。
进行系统聚类分析，打开相关统计分析软件，点击文件，将10批次真实样品和5批次掺杂物数据导入软件。在菜单中的分类选项卡下，单击分析和系统聚类。选择10批次真实样品和5批次掺杂物的共同峰面积作为变量。
将聚类数设置为 4。接下来，单击“方法”以选择“聚类方法”作为组间连接。选择测量间隔作为 Pearson 相关性，然后使用确定选项卡绘制聚类分析地图。
对于主成分分析或 PCA，请打开数据分析软件。单击菜单上的文件，然后创建一个新的常规项目。从HPLC系统导入Excel或类似电子表格中12个常见峰的峰面积。
打 结束通话 按钮完成数据导入。要使用 PCA 设置模型类型，请单击“新建”创建新模型，然后使用自动调整和添加选项卡拟合数据。转到分数以获取 PCA 分数图。
使用正交偏最小二乘判别分析或 OPLSDA。生成 PCA 分数图，如前所述。使用 OPLSDA 设置模型类型，方法是单击“新建”和“新建”作为模型一 在进行缩放之前，为所有标准杆选择标准杆，然后点击分数自动拟合以生成 OPLSDA 分数图。
要估计变量重要性和预测，请转到数据分析软件菜单并转到分析，然后将每个突变下的数字设置为 200。从OPLSDA分数中获取R平方和Q平方值，然后单击VIP和VIP预测以获取VIP地图。10份真品川木通样品的HPLC指纹图谱显示12个不同的共同峰，其中峰相对较大且分离度较好。
使用峰数10作为参考峰来估计其余峰的相对保留时间。真实样本的相似度非常接近1，这意味着高度相似，一致性良好。但5批掺杂物与对照川木通的相似度较低。
观察到五种掺杂物的HPLC指纹图谱与真实样品不同，主要在保留时间为28至55分钟的区域。除掺杂物CC外，PCA与掺杂物品种之间有明显的相似性，与掺杂物的差异性也相似，分类距离为20时，聚类分析也得到相似结果。OPLSDA生成的评分矩阵表明，真实样品的采样点与掺杂物之间没有交集。
同样，掺假CC比其他掺杂物更像正宗品种。根据VIP图，数值大于1的峰被确定为导致真实样品和掺杂物差异的主要标记成分。在川木桐中发现的活性成分β-谷甾醇的含量在所有5批掺杂物中均得到检测，但含量差异较大。
该协议建立了多种分析方法，从多个角度反映有关药材的所有信息，并全方位估计川木通药材的真实性。
