このプロトコルは、クレマチディス・アルマンディ・カリスとその偽和物の真正材料を効果的に識別するための新しい戦略を提供することができます。この方法は、医薬品の品質研究に使用でき、他の漢方薬品の品質基準を研究するためのリファレンスを提供します。サンプル調製を開始するには、適切な内径のナイロンメッシュに原料を通過させて、原料を均一な粒子サイズに粉砕します。
50ミリリットルのメタノールをフラスコに加える前に、2グラムの粉砕原料を栓付きの50ミリリットルの円錐フラスコに正確に計量した。600ワットと40キロヘルツで30分間加熱された超音波でフラスコに栓を置きます。インキュベーションの終わりに、ろ紙を通して薬用抽出物溶液をこすります。
濾した後、薬用抽出物を含むメタノール溶液4ミリリットルを10ミリリットルのメスフラスコに移します。それからそれに6ミリリットルの水を加えて、そして溶液を混ぜる。溶液を10分間沈降させます。
サンプルのHPLC分析用。まず、移動相を準備し、原稿に記載されているようにHPLCグラジエントプログラムを設定します。0.45ミクロンのマイクロポーラスフィルターメンブレンでサンプルをろ過し、HPLC分析にかけます。
各サンプルについて、1日6回分析を行います。サンプル溶液の安定性を評価するには、調製後0、2、4、6、8、12、および24時間室温で保存した同じサンプル溶液を分析します。同じサンプルの6回の反復を採取し、HPLCでその指紋を検出します。
関連するデータを、漢方薬のクロマトグラフィー指紋の類似性評価システムまたはSESCF TCMバージョン2012という名前のソフトウェアにインポートします。分析のために、本物のチュアンムトンサンプルの10バッチすべてと不純物の5バッチの保持時間とピーク面積をSESCF TCMにインポートします。メインメニューで、設定された参照スペクトルをクリックし、パラメータ設定ウィンドウに移動して、Chuanmutongの本物の種の参照クロマトグラフィーフィンガープリントを基準として設定します。
次に、制御スペクトル生成方法を中央値法として設定し、タイム ウィンドウ幅を 0.5 に設定します。次に、メインメニューのマルチポイントキャリブレーションをクリックし、ピークを選択してから、マークされたピークとしてピークマッチングオプションを選択します。最後に、[類似度の計算]をクリックして、Chuanmutongの参照クロマトグラムフィンガープリントに基づいてサンプルの類似性分析を実行します。
全身クラスター分析を実行するには、関連する統計分析ソフトウェアを開き、ファイルをクリックして、本物のサンプルの10バッチと不純物の5バッチのデータをソフトウェアにインポートします。メニューの [分類] タブで、[分析とシステム クラスタリング] をクリックします。変数として、10バッチの真正サンプルと5バッチの混入物の一般的なピーク領域を選択します。
クラスターの数を 4 に設定します。次に、[方法]をクリックして、グループ間接続としてクラスタリング方法を選択します。測定間隔をピアソン相関として選択し、[OK]タブを使用してクラスター分析マップを描画します。
主成分分析またはPCAの場合は、データ分析ソフトウェアを開きます。メニューのファイルをクリックし、新しい通常のプロジェクトを作成します。HPLCシステムからExcelまたは同様のスプレッドシートで12の一般的なピークのピーク面積をインポートします。
ヒット 完了 ボタンをクリックして、データのインポートを完了します。PCAでモデルタイプを設定するには、[新規]をクリックして新しいモデルを作成し、自動調整と追加タブを使用してデータを適合させます。スコアに移動して、PCAスコアマップを取得します。
直交偏最小二乗判別分析またはOPLSDAを使用します。前に示したように、PCA スコア マップを生成します。をクリックしてOPLSDAでモデルタイプを設定します 新規 及び 新規 モデル1として スケールインする前に すべてのパーを選択し、次にスコアで自動調整を押してOPLSDAスコアマップを生成します。
変数の重要度と射影を推定するには、データ分析ソフトウェアメニューに移動し、分析に移動してから、突然変異ごとに数値を200に設定します。OPLSDAスコアからR二乗とQ二乗の値を取得し、VIPおよびVIP予測をクリックしてVIPマップを取得します。10個の本物のチュアンムトンサンプルのHPLCフィンガープリントは、12の異なる共通のピークを示し、そのうち比較的大きく、よく解像されました。
ピーク数10を基準ピークとして用い、残りのピークの相対保持時間を推定した。本物のサンプルは、1に非常に近い類似度を示し、良好な一貫性で高い類似性を意味します。しかし、混入物の5つのバッチと対照のチュアンムトンの間の類似度は非常に低かった。
5つの不純物のHPLCフィンガープリントは、主に28〜55分の保持時間を持つ領域で、本物のサンプルとは異なることが観察されました。PCAは、真正品種と混入物CCとの差との間に明らかな類似性を示し、分類距離が20の場合のクラスター分析からも同様の結果が得られました。OPLSDAから生成されたスコアマトリックスは、本物のサンプルのサンプルポイントと偽和物の間に交差がないことを示しました。
繰り返しになりますが、偽和物CCは他の姦淫物よりも本物の品種に似ていました。VIPマップによると、1より大きい値を持つピークが、本物のサンプルと混入物の違いを引き起こす主要なマーカー成分として特定されました。チュアンムトンに含まれる有効成分であるベータシトステロールの含有量は、混和物の5つのバッチすべてで検出されましたが、含有量は大きく異なりました。
このプロトコルは、医薬品に関するすべての情報を複数の角度から反映し、チュアンムートンの医薬品の信憑性を推定するためのさまざまな分析方法を確立します。
