이 프로토콜은 클레마티디스 아르만디 콜리스와 그 간음제의 진짜 재료를 효과적으로 식별하기 위한 새로운 전략을 제공할 수 있습니다. 이 방법은 약재 품질 연구에 사용할 수 있으며 다른 중국 의약 재료의 품질 표준을 연구하기위한 참고 자료를 제공합니다. 샘플 준비를 시작하려면 적절한 내경을 가진 나일론 메쉬를 통과시켜 균일 한 입자 크기로 원료를 분쇄하십시오.
플라스크에 메탄올 50ml를 첨가하기 전에 분쇄 된 원료 2g을 마개 50 밀리리터 원추형 플라스크에 정확하게 계량했습니다. 30 분 동안 600 와트 및 40 킬로 헤르츠로 가열 된 초음파로 플라스크에 마개를 놓습니다. 배양이 끝나면 여과지를 통해 약용 추출 용액을 변형시킵니다.
변형시킨 후, 약용 추출물을 함유하는 메탄올 용액 4 밀리리터를 10 밀리리터의 부피 플라스크에 옮긴다. 그런 다음 6 밀리리터의 물을 넣고 용액을 혼합하십시오. 용액을 10 분 동안 가라 앉히십시오.
샘플의 HPLC 분석을 위해. 이동상을 준비하는 것으로 시작하고 원고에 설명 된대로 HPLC 그래디언트 프로그램을 설정하십시오. 0.45 마이크론 마이크로 다공성 필터 멤브레인을 통해 샘플을 여과하고 HPLC 분석을 실시합니다.
각 샘플에 대해 하루에 6 번 분석을 수행하십시오. 시료액의 안정성을 평가하려면 제조 후 0, 2, 4, 6, 8, 12 및 24시간 동안 실온에서 보관된 동일한 시료 용액을 분석합니다. 동일한 샘플의 6 회 반복을 취하고 HPLC에서 지문을 검출합니다.
관련 데이터를 중국 전통 의학의 크로마토 그래피 지문의 유사성 평가 시스템 또는 SESCF TCM 버전 2012라는 소프트웨어로 가져옵니다. 분석을 위해 정통 Chuanmutong 샘플의 10개 배치와 불순물 5개 배치에 대한 머무름 시간과 피크 영역을 SESCF TCM으로 가져옵니다. 메인 메뉴에서 참조 스펙트럼 설정을 클릭하고 매개 변수 설정 창으로 이동하여 Chuanmutong의 정통 종의 참조 크로마토 그래피 지문을 참조로 설정합니다.
다음으로, 제어 스펙트럼 생성 방법을 시간 창 너비가 0.5인 중앙값 방법으로 설정합니다. 그런 다음 기본 메뉴에서 다점 보정을 클릭하고 피크를 선택한 다음 피크 일치 옵션을 표시된 피크로 선택합니다. 마지막으로 유사성 계산을 클릭하여 Chuanmutong의 기준 크로마토그램 지문을 기반으로 샘플의 유사성 분석을 수행합니다.
체계적인 클러스터 분석을 수행하려면 관련 통계 분석 소프트웨어를 열고 파일을 클릭하여 10 배치의 실제 샘플과 5 배치의 불순물 데이터를 소프트웨어로 가져옵니다. 메뉴의 분류 탭에서 분석 및 시스템 클러스터링을 클릭합니다. 10개의 정통 샘플 배치와 5개의 불순물 배치의 공통 피크 영역을 변수로 선택합니다.
클러스터 수를 4로 설정합니다. 그런 다음 방법을 클릭하여 클러스터링 방법을 그룹 간 연결로 선택합니다. 측정 구간을 Pearson 상관 관계로 선택하고 확인 탭을 사용하여 군집 분석 맵을 그립니다.
원리 성분 분석 또는 PCA의 경우 데이터 분석 소프트웨어를 엽니다. 메뉴에서 파일을 클릭하고 새 일반 프로젝트를 만듭니다. HPLC 시스템에서 Excel 또는 유사한 스프레드시트에 있는 12개의 공통 피크의 피크 영역을 가져옵니다.
을 치다 마감재 버튼을 눌러 데이터 가져오기를 완료합니다. PCA로 모델 유형을 설정하려면 새로 만들기를 클릭하여 새 모델을 만든 다음 자동 맞춤 및 탭 추가를 사용하여 데이터를 피팅합니다. 점수로 이동하여 PCA 점수 맵을 가져옵니다.
직교 부분 최소 제곱 판별 분석 또는 OPLSDA를 사용합니다. 앞에서 설명한 대로 PCA 점수 맵을 생성합니다. 새로 만들기 및 새로 만들기를 클릭하여 OPLSDA로 모델 유형을 설정합니다. 모델 1 모두에 대한 파를 선택하여 스케일링하기 전에 점수에서 자동 맞춤을 눌러 OPLSDA 점수 맵을 생성합니다.
변수 중요도와 투영을 추정하려면 데이터 분석 소프트웨어 메뉴로 이동하여 분석으로 이동 한 다음 숫자를 돌연변이 당 200으로 설정하십시오. OPLSDA 점수에서 R 제곱 및 Q 제곱 값을 얻고 VIP 및 VIP 예측을 클릭하여 VIP 맵을 가져옵니다. 10개의 정통 Chuanmutong 샘플의 HPLC 지문은 12개의 뚜렷한 공통 피크를 보여주었으며 그 중 비교적 크고 잘 해결되었습니다.
피크 번호 10은 나머지 피크의 상대적 머무름 시간을 추정하기 위해 기준 피크로 사용되었습니다. 실제 샘플은 양호한 일관성에서 높은 유사성을 암시하는 유사성 정도에 매우 가까운 유사성을 보여주었습니다. 그러나 5 개의 간음자 배치와 통제 Chuanmutong 사이의 유사도는 상당히 낮았습니다.
5 개의 불순물의 HPLC 지문은 주로 28 분에서 55 분 범위의 머무름 시간을 갖는 영역에서 실제 샘플과 다른 것으로 관찰되었습니다. PCA는 불순물이 섞인 CC를 제외하고는 정통 품종과 간음 자와의 차이점 사이에 명백한 유사성을 보여주었습니다.분류 거리가 20 일 때 클러스터 분석에서도 유사한 결과를 얻었습니다. OPLSDA에서 생성된 스코어 매트릭스는 실제 샘플의 샘플 포인트와 불순물 사이에 교차점이 없음을 나타냅니다.
다시 말하지만, 간음한 CC는 다른 간음자보다 정통 품종과 더 닮았습니다. VIP 맵에 따르면 1보다 큰 값을 갖는 피크가 실제 샘플과 불순물 간의 차이를 일으키는 주요 마커 구성 요소로 식별되었습니다. Chuanmutong에서 발견되는 활성 성분 인 베타-시토스테롤의 함량은 5 가지 불순물 배치에서 모두 검출되었지만 함량은 크게 달랐습니다.
이 프로토콜은 다양한 분석 방법을 설정하여 약재에 대한 모든 정보를 여러 각도에서 반영하고 Chuanmutong 약재의 진위 여부를 추정하는 방법을 제공합니다.
