孔雀石绿测定法用于发现热休克蛋白 90 抑制剂

该协议将通过测量蛋白质水解产生的ATP水解产生的游离磷酸盐来帮助确定ATP酶蛋白的活性。孔雀石绿色测定是一种简单、灵敏、快速且廉价的无机磷酸盐检测程序。它适用于针对其靶标的化合物的自动化和高通量筛选。

该技术将在快速发现针对Hsp90蛋白的抑制剂中发挥重要作用，Hsp90蛋白是重要的抗癌靶点。首先，将40微摩尔一毫摩尔磷酸盐标准品移入960微纯水中，得到40微摩尔磷酸盐溶液。按照制造商的说明添加此溶液，以形成0至40微摩尔的磷酸盐系列稀释液。

接下来，使用八微升酵母Hsp90进行可测量的ATP酶活性。向空白和阳性对照中加入孔雀石绿试剂，并检查加入后的空白与阳性对照之间的光密度差至少为0.5且小于1。要制备ATP，将一毫克ATP转移到含有453.39微升超纯水的小瓶中，以获得4毫摩尔储备溶液。

准备新鲜的ATP，因为它会随着时间的推移自发水解。向每个孔中加入四微升ATP储备溶液，使最终孔浓度为0.2毫摩尔。使用多通道移液管将ATP作为反应的最后一个组分添加到反应中，以便所有反应同时开始。

接下来，通过将 1 毫克溶解在 178.37 微升 DMSO 中来制备 10 毫摩尔的凝胶霉素储备液。使用储备溶液，通过连续稀释在DMSO中制备4毫摩尔、0.8毫摩尔、0.16毫摩尔、0.032毫摩尔、0.0064毫摩尔和0.00128毫摩尔溶液。向每个孔中加入两微升这些储备溶液，以获得最终孔浓度为0.1毫摩尔、0.02毫摩尔、0.04毫摩尔、0.0008毫摩尔、0.00016毫摩尔和0.000032毫摩尔。

然后，准备孔以及包含空白和阴性对照的孔。含有凝胶霉素的孔作为阳性对照。准备96孔板，并为在620纳米处显示吸光度的化合物准备一个单独的孔，以记录该波长下的吸光度。

不要显示凝胶达他霉素的单独孔，因为凝胶霉素在该测定中使用的浓度在620纳米处不显示吸光度。通过向每个孔中添加超纯水来设置测定孔。然后，加入所需量的测定缓冲液和复合溶液，例如凝胶霉素溶液。

将Hsp90添加到适当的孔中，并在室温下在平板振动器上摇动板两分钟。使用多通道移液器加入四微升ATP溶液。用铝箔包裹板，并在室温下以 200 rpm 在摇板器上摇晃两分钟。

将板在 37 摄氏度下孵育三小时。使用多通道移液管以与ATP相同的顺序加入20微升孔雀石绿试剂，并在室温下孵育15分钟，从而停止反应。最后，在读板器中测量板在620纳米处的吸光度。

除板A外，在每个孔中加入90微升测定缓冲液。除板B外，在每个孔中加入90微升含有Hsp90的缓冲液。在加板C中，加入90微升ATP，在加板D中，每孔加入90微升孔雀石绿试剂。

使用自动多通道分液系统将 40 微升溶液从加板 A 的每个孔转移到主板 1 和 2，将板 B 转移到主板 3 和 4。将20微升溶液从复合板的每个孔转移到主板一，主板二，主板三和主板四。在摇床中以 200 rpm 的速度摇动盘子一分钟。

将20微升溶液从加板C的每个孔转移到主板一，二，三和四。在摇床中以 200 rpm 的速度摇动盘子一分钟。将板在 37 摄氏度下孵育 3 小时，然后将 20 微升孔雀石绿试剂从添加板 D 转移到主板 1、2、3 和 4 的孔中。

在室温下孵育15分钟后，在读板器中测量板在620纳米处的吸光度。这里显示了孔雀石绿的结构以及孔雀石绿试剂A与游离磷酸盐的反应以及随后与试剂B的反应。该图表示标准磷酸盐浓度的标准图。

在这里，x轴表示以微摩尔为单位的游离磷酸盐或pi浓度，620纳米处的吸光度在y轴上表示。误差线表示两个样本数之间的偏差。ATP酶活性百分比用于测量凝胶达那霉素对蛋白质的剂量依赖性抑制。

观察到凝胶霉素以剂量依赖性方式抑制蛋白质，IC50值为0.85微摩尔。在这里，每个点都是两个确定的平均值。添加孔雀石绿剂后主板一的颜色发展如图所示。

A11孔中的粉红色是由于复合颜色。同样，这里显示了主板二的颜色发展。A11孔中的粉红色是由于化合物的有色性质。

此处显示了在主板三和主板四中添加孔雀石绿试剂后的颜色发展。在尝试此过程时，以相同的时间间隔向每个孔中添加ATP和孔雀石绿试剂是要记住的重要事项。