我们的PLA方案允许识别和量化膜接触位点蛋白质之间的内源性相互作用。我们已经用它来研究内质网线粒体接触位点的两种内质网蛋白之间的相互作用。该技术将PLA与细胞器染色和细胞器距离分析相结合。
它允许定位和量化细胞间膜接触位点蛋白质之间的相互作用。执行邻近连接测定或 PLA 和图像采集后，设置细胞分析软件以启动 MATLAB 并通过单击 Mac 操作系统中的选项 Imaris 或 Windows 中的编辑菜单来启动扩展。选择首选项，切换到自定义工具面板，然后设置路径。
要将图像导入软件，请直接通过竞技场部分或使用允许批量转换的独立文件转换器将共聚焦堆栈图像转换为IMS文件。导入后，单击编辑，转到图像属性，然后选择图像几何图形以检查图像校准。检查体素大小是否与X和Y中实际图像的预期像素大小相对应，以及显微镜生成Z堆栈的步骤 Z.To 调整不同通道的对比度 单击菜单中的编辑，转到显示调整，然后选择显示调整。
独立调整每个通道以优化每种颜色的显示。此步骤对于设置精确的阈值或检测弱对象至关重要。然后，单击编辑并选择裁剪 3D，通过裁剪图像将分析限制为单个单元格。
要分析同一视野中的另一个单元格，请再次打开同一图像并以不同的方式裁剪。通过单击添加新光斑选项来检测在ORP5和ORP8相互作用位置生成的PLA信号，这将创建一组新对象并打开光斑检测向导。选择应执行点检测的通道。
调整估计的XY直径，以帮助光斑检测算法找到感兴趣的对象。如果选择的值太高，附近的物体会融合，如果值太小，可能会检测到异常信号。现在，单击背景减法以在点检测之前删除图像背景，以增强感兴趣对象周围的局部对比度。
通过在软件自动阈值中将质量保留为阈值参数来调整点检测阈值，或稍微修改此值以检测所有对象。点检测完成后，保存检测参数并重复使用它们来处理其他图像。然后，通过单击添加新表面以创建新对象并打开表面检测向导来检测线粒体网络以生成表面渲染。
选取应在其上执行曲面创建的通道。应用高斯滤波器以获得更光滑的表面，方法是单击平滑复选框，并设置一个阈值，指示表面上可观察到的次要细节。然后，执行背景减法以增强局部对比度，并根据信号强度调整阈值以检测线粒体网络。
通过在分类表面窗口中选择体素过滤器的数量，在表面上应用过滤器以从阈值中移除小残差，并使用上限和下限阈值以仅保留感兴趣的对象。曲面创建结束后，保存创建参数并重复使用它们来处理其他图像。要在创建的线粒体表面之外生成距离图，请在场景树框中选择线粒体表面。
单击图像处理并选择表面功能，然后进行距离变换。将显示一个 MATLAB 扩展，要求用户选择是应该在对象表面外部还是内部计算地图。选择外表面物体以测量PLA点与线粒体表面之间的距离。
生成地图后，它将在显示调整面板中显示为新通道。在这个通道中，每个像素都有一个对应于到最近线粒体的距离的值。选择之前在场景树框中生成的点，以测量每个点到最近线粒体的距离，并识别和可视化最近的线粒体。
现在，在统计和详细日志中选择与距离图对应的通道的特定值和中心强度，以测量每个点中心的值，该值对应于其到距离图中最接近线粒体的距离。通过单击窗口左下角的软盘图标将数据导出为 CSV 文件。要根据斑点到线粒体的距离提取斑点子群，请在场景树中选择斑点，然后单击过滤器选项卡。
根据此窗口中距离图对应的通道中心强度添加新的过滤器，通过将下限阈值设置为零微米，上限阈值设置为0.380微米来提取距离线粒体小于380纳米的斑点。通过按将所选内容复制到新点按钮以聚焦于所选光斑来执行复制步骤。内源性ORP5-ORP8 PLA的共聚焦图像显示与线粒体（通常称为线粒体相关ER膜）密切接触的网状ER，皮质ER和ER亚域中的HeLa细胞相互作用。
3D成像分析显示，约50%的内源性ORP5-ORP8 PLA相互作用在线粒体相关ER膜上检测到。在共过表达ORP5和ORP8的细胞中，在线粒体相关ER膜上发生的ORP5-ORP8 PLA相互作用的百分比与在这些蛋白质以内源水平表达的细胞中观察到的百分比相似。ORP5和ORP8下调诱导PLA信号总数大幅减少，而它们的共过表达增加了PLA。
在ORP5-PTPIP51和ORP8-PTPIP51偶中检测到PLA信号，其平均数量与ORP5-ORP8 PLA偶联相似，证实了ORP5和ORP8在ER-线粒体膜接触位点的定位。此外，使用转染有PHPLCD-RFP或mCherry-PLN1的HeLa细胞鉴定ORP5-ORP8 PLA在线粒体，ER和脂滴之间的三向接触位点中的ER质膜接触处的相互作用。与任何图像分析方法一样，图像质量是一个关键点，因此信号的优化对于自动检测物体具有决定性作用。
该技术也可用于研究两个或多个细胞器之间的关联，正如我们最近在三方ER，线粒体，脂滴接触位点对ORP5和ORP8功能的研究所做的那样。该技术有助于细胞内通讯领域的其他研究，以识别新的多部分细胞器间关联。
