Il nostro protocollo PLA permette di identificare e quantificare l'interazione endogena tra proteine nei siti di contatto con la membrana. Lo abbiamo usato per studiare l'interazione tra due proteine del reticolo endoplasmatico nei siti di contatto mitocondriale del reticolo endoplasmatico. Questa tecnica combina il PLA con la colorazione degli organelli e l'analisi delle distanze degli organelli.
Permette di localizzare e quantificare l'interazione tra proteine nei siti di contatto inter-organelli. Dopo aver eseguito il test di legatura di prossimità, o PLA, e l'acquisizione delle immagini, impostare il software di analisi cellulare per avviare MATLAB e avviare un'estensione facendo clic sull'opzione Imaris nel sistema operativo Mac o nel menu di modifica in Windows. Selezionare le preferenze, passare al pannello degli strumenti personalizzati e impostare il percorso.
Per importare le immagini nel software, converti le immagini della pila confocale in un file IMS, direttamente tramite la sezione arena o utilizzando il convertitore di file autonomo che consente la conversione batch. Dopo l'importazione, fai clic su modifica, vai alle proprietà dell'immagine e seleziona la geometria dell'immagine per controllare la calibrazione dell'immagine. Verificare che la dimensione del voxel corrisponda alla dimensione in pixel prevista per l'immagine effettiva in X e Y e che il passo applicato dal microscopio per generare lo stack Z in Z.To regolare il contrasto dei diversi canali Fare clic su Modifica nel menu, andare alla regolazione del display e selezionare Mostra regolazione del display.
Regola ogni canale in modo indipendente per ottimizzare la visualizzazione di ciascun colore. Questo passaggio è essenziale per impostare soglie precise o rilevare oggetti deboli. Quindi, fai clic su modifica e seleziona ritaglia 3D per limitare l'analisi a una singola cella ritagliando l'immagine.
Per analizzare un'altra cella nello stesso campo visivo, aprite di nuovo la stessa immagine e ritagliatela in modo diverso. Rileva i segnali PLA generati nella posizione dell'interazione ORP5 e ORP8 facendo clic sull'opzione aggiungi nuovi punti, che crea un nuovo set di oggetti e apre la procedura guidata di rilevamento dei punti. Selezionare il canale su cui deve essere eseguito il rilevamento spot.
Regolare il diametro XY stimato per aiutare l'algoritmo di rilevamento spot a trovare gli oggetti di interesse. Se il valore scelto è troppo alto, gli oggetti vicini si fonderanno e, se il valore è troppo piccolo, potrebbero essere rilevati segnali aberranti. Ora, fai clic sulla sottrazione dello sfondo per rimuovere lo sfondo dell'immagine prima del rilevamento del punto per migliorare il contrasto locale intorno agli oggetti di interesse.
Regolare la soglia di rilevamento del punto mantenendo la qualità come parametro di soglia nella soglia automatica del software, oppure modificare leggermente questo valore per rilevare tutti gli oggetti. Una volta terminato il rilevamento spot, salvare i parametri di rilevamento e riutilizzarli per elaborare altre immagini. Quindi, rilevare la rete mitocondriale per generare un rendering della superficie facendo clic su aggiungi nuove superfici per creare un nuovo oggetto e aprire la procedura guidata di rilevamento della superficie.
Selezionate il canale su cui deve essere eseguita la creazione della superficie. Applicare il filtro gaussiano per ottenere una superficie più liscia facendo clic sulla casella di controllo Arrotonda e impostando una soglia che indica i dettagli minori osservabili sulla superficie. Successivamente, eseguire una sottrazione di fondo per migliorare i contrasti locali e regolare la soglia per rilevare la rete mitocondriale in base all'intensità del segnale.
Applicare un filtro sulla superficie per rimuovere piccoli residui dalla soglia selezionando il numero di voxel filtro nella finestra di classificazione della superficie e giocare con le soglie superiore e inferiore per mantenere solo gli oggetti di interesse. Una volta terminata la creazione della superficie, salvate i parametri di creazione e riutilizzateli per elaborare altre immagini. Per generare una mappa di distanza all'esterno della superficie mitocondriale creata, selezionare la superficie dei mitocondri nella casella dell'albero della scena.
Fare clic su Elaborazione immagine e selezionare la funzione superfici, seguita dalla trasformazione della distanza. Verrà visualizzata un'estensione MATLAB che chiede all'utente di scegliere se la mappa deve essere calcolata all'esterno o all'interno della superficie dell'oggetto. Selezionare l'oggetto della superficie esterna per misurare la distanza tra i punti PLA e la superficie dei mitocondri.
Una volta generata, la mappa viene visualizzata come un nuovo canale nel pannello di regolazione del display. In questo canale, ogni pixel ha un valore corrispondente alla distanza dai mitocondri più vicini. Selezionare i punti generati in precedenza nella casella dell'albero della scena per misurare la distanza da ciascun punto al mitocondrio più vicino e identificare e visualizzare quelli più vicini.
Ora, seleziona i valori specifici e l'intensità del centro del canale corrispondente alla mappa della distanza nelle statistiche e nel registro dettagliato per misurare il valore di ogni centro spot, che corrisponde alla sua distanza dal mitocondrio più vicino alla mappa della distanza. Esporta i dati come file CSV facendo clic sull'icona del disco floppy in basso a sinistra della finestra. Per estrarre una sottopopolazione di macchie in base alla loro distanza dai mitocondri, selezionare le macchie nell'albero della scena e fare clic sulla scheda dei filtri.
Aggiungi un nuovo filtro basato sull'intensità centrale del canale corrispondente alla mappa della distanza in questa finestra ed estrai i punti a meno di 380 nanometri di distanza dai mitocondri impostando la soglia inferiore a zero micrometri e la soglia superiore a 0,380 micrometri. Eseguire una fase di duplicazione premendo il pulsante Duplica selezione in nuovi punti per mettere a fuoco i punti selezionati. Le immagini confocali del PLA endogeno ORP5-ORP8 hanno mostrato interazioni nelle cellule HeLa nei sottodomini reticolari ER, corticali ER e ER a stretto contatto con i mitocondri, comunemente indicati come membrane ER associate ai mitocondri.
L'analisi di imaging 3D ha rivelato che circa il 50% delle interazioni endogene ORP5-ORP8 PLA sono state rilevate a livello delle membrane ER associate ai mitocondri. La percentuale di interazioni PLA ORP5-ORP8 che si verificano nelle membrane ER associate ai mitocondri nelle cellule che co-sovraesprimono ORP5 e ORP8 era simile a quella osservata nelle cellule in cui queste proteine erano espresse a livelli endogeni. La sottoregolazione di ORP5 e ORP8 ha indotto una massiccia diminuzione del numero totale di segnali di PLA, mentre la loro co-sovraespressione ha aumentato il PLA.
I segnali PLA sono stati rilevati nelle coppie ORP5-PTPIP51 e ORP8-PTPIP51 e i loro numeri medi erano simili alla coppia PLA ORP5-ORP8, confermando la localizzazione di ORP5 e ORP8 nei siti di contatto della membrana ER-mitocondri. Inoltre, l'interazione del PLA ORP5-ORP8 a contatto con la membrana plasmatica dell'ER in un sito di contatto a tre vie tra mitocondri, ER e goccioline lipidiche viene identificata utilizzando cellule HeLa trasfettate con PHPLCD-RFP o mCherry-PLN1. Come in qualsiasi metodo di analisi delle immagini, la qualità dell'immagine è un punto chiave, quindi l'ottimizzazione del segnale è decisiva per il rilevamento automatico degli oggetti.
Questa tecnica può essere utilizzata anche per studiare le associazioni tra due o più organelli cellulari, come abbiamo fatto nel nostro recente studio sulla funzione di ORP5 e ORP8 nei siti di contatto a tre parti ER, mitocondri e goccioline lipidiche. Questa tecnica può essere utile in altri studi nel campo della comunicazione intracellulare per identificare nuove associazioni multipartipartite tra gli organelli.
