Notre protocole PLA permet d’identifier et de quantifier l’interaction endogène entre les protéines au niveau des sites de contact membranaire. Nous l’avons utilisé pour étudier l’interaction entre deux protéines du réticulum endoplasmique au niveau des sites de contact mitochondrial du réticulum endoplasmique. Cette technique combine le PLA avec des colorations d’organites et l’analyse des distances d’organites.
Il permet de localiser et de quantifier l’interaction entre les protéines au niveau des sites de contact entre les organites membranaires. Après avoir effectué un test de ligature de proximité, ou PLA, et l’acquisition d’images, configurez le logiciel d’analyse cellulaire pour démarrer MATLAB et lancer une extension en cliquant sur l’option Imaris dans le système d’exploitation Mac ou dans le menu Édition sous Windows. Sélectionnez les préférences, accédez au panneau d’outils personnalisés et définissez le chemin d’accès.
Pour importer les images dans le logiciel, convertissez les images de la pile confocale en un fichier IMS, soit directement via la section Arena, soit à l’aide du convertisseur de fichiers autonome qui permet la conversion par lots. Après l’importation, cliquez sur modifier, allez dans les propriétés de l’image et sélectionnez la géométrie de l’image pour vérifier le calibrage de l’image. Vérifiez que la taille du voxel correspond à la taille de pixel attendue pour l’image réelle en X et Y, et à l’étape appliquée par le microscope pour générer la pile Z dans Z.To ajustez le contraste des différents canaux Cliquez sur Modifier dans le menu, accédez au réglage de l’affichage, puis sélectionnez Afficher le réglage de l’affichage.
Ajustez chaque canal indépendamment pour optimiser l’affichage de chaque couleur. Cette étape est essentielle pour définir des seuils précis ou détecter des objets faibles. Ensuite, cliquez sur Modifier et sélectionnez Recadrer 3D pour limiter l’analyse à une seule cellule en recadrant l’image.
Pour analyser une autre cellule dans le même champ de vision, ouvrez à nouveau la même image et recadrez-la différemment. Détectez les signaux PLA générés à l’emplacement de l’interaction ORP5 et ORP8 en cliquant sur l’option ajouter de nouveaux points, ce qui crée un nouvel ensemble d’objets et ouvre l’assistant de détection de spots. Sélectionnez le canal sur lequel la détection ponctuelle doit être effectuée.
Ajustez le diamètre XY estimé pour aider l’algorithme de détection ponctuelle à trouver les objets d’intérêt. Si la valeur choisie est trop élevée, les objets proches fusionneront, et si la valeur est trop petite, des signaux aberrants peuvent être détectés. Maintenant, cliquez sur soustraction de l’arrière-plan pour supprimer l’arrière-plan de l’image avant la détection ponctuelle afin d’améliorer le contraste local autour des objets d’intérêt.
Ajustez le seuil de détection spot en conservant la qualité comme paramètre de seuil dans le seuil automatique du logiciel, ou modifiez légèrement cette valeur pour détecter tous les objets. Une fois la détection ponctuelle terminée, enregistrez les paramètres de détection et réutilisez-les pour traiter d’autres images. Ensuite, détectez le réseau mitochondrial pour générer un rendu de surface en cliquant sur ajouter de nouvelles surfaces pour créer un nouvel objet et ouvrez l’assistant de détection de surface.
Sélectionnez le canal sur lequel la création de la surface doit être effectuée. Appliquez un filtre gaussien pour obtenir une surface plus lisse en cochant la case Lissage et en définissant un seuil indiquant les détails mineurs observables sur la surface. Ensuite, effectuez une soustraction d’arrière-plan pour améliorer les contrastes locaux et ajustez le seuil pour détecter le réseau mitochondrial en fonction de l’intensité du signal.
Appliquez un filtre sur la surface pour supprimer les petits résidus du seuil en sélectionnant le filtre du nombre de voxels dans la fenêtre de classification de la surface, et jouez avec les seuils supérieur et inférieur pour ne conserver que les objets d’intérêt. Une fois la création de la surface terminée, enregistrez les paramètres de création et réutilisez-les pour traiter d’autres images. Pour générer une carte de distance à l’extérieur de la surface mitochondriale créée, sélectionnez la surface des mitochondries dans la zone de l’arborescence de la scène.
Cliquez sur Traitement d’image et sélectionnez la fonction Surfaces, suivie de la transformation de distance. Une extension MATLAB demandant à l’utilisateur de choisir si la carte doit être calculée à l’extérieur ou à l’intérieur de la surface de l’objet s’affiche. Sélectionnez l’objet de surface extérieure pour mesurer la distance entre les taches PLA et la surface des mitochondries.
Une fois la carte générée, elle apparaît sous la forme d’un nouveau canal dans le panneau de réglage de l’affichage. Dans ce canal, chaque pixel a une valeur correspondant à la distance aux mitochondries les plus proches. Sélectionnez les points précédemment générés dans la zone de l’arborescence de la scène pour mesurer la distance entre chaque point et la mitochondrie la plus proche, puis identifiez et visualisez les plus proches.
Maintenant, sélectionnez des valeurs spécifiques et l’intensité du centre du canal correspondant à la carte de distance dans les statistiques et le journal détaillé pour mesurer la valeur de chaque centre de spot, qui correspond à sa distance à la mitochondrie la plus proche dans la carte de distance. Exportez les données sous forme de fichier CSV en cliquant sur l’icône de la disquette en bas à gauche de la fenêtre. Pour extraire une sous-population de taches en fonction de leur distance aux mitochondries, sélectionnez les taches dans l’arborescence de la scène et cliquez sur l’onglet Filtres.
Ajoutez un nouveau filtre basé sur l’intensité centrale du canal correspondant à la carte de distance dans cette fenêtre, et extrayez les taches à moins de 380 nanomètres des mitochondries en réglant le seuil inférieur à zéro micromètre et le seuil supérieur à 0,380 micromètre. Effectuez une étape de duplication en appuyant sur le bouton Dupliquer la sélection vers de nouveaux points pour vous concentrer sur les points sélectionnés. Des images confocales de PLA ORP5-ORP8 endogène ont montré des interactions dans les cellules HeLa dans les sous-domaines réticulaire ER, Cortical RE et ER en contact étroit avec les mitochondries, communément appelées membranes ER associées aux mitochondries.
L’analyse par imagerie 3D a révélé qu’environ 50 % des interactions endogènes ORP5-ORP8 PLA ont été détectées au niveau des membranes RE associées aux mitochondries. Le pourcentage d’interactions ORP5-ORP8 PLA se produisant au niveau des membranes ER associées aux mitochondries dans les cellules co-surexprimant ORP5 et ORP8 était similaire à celui observé dans les cellules où ces protéines étaient exprimées à des niveaux endogènes. La régulation négative de l’ORP5 et de l’ORP8 a induit une diminution massive du nombre total de signaux PLA, tandis que leur co-surexpression a augmenté le PLA.
Des signaux PLA ont été détectés dans les couples ORP5-PTPIP51 et ORP8-PTPIP51, et leur nombre moyen était similaire à celui du couple PLA ORP5-ORP8, confirmant la localisation d’ORP5 et d’ORP8 aux sites de contact de la membrane ER-mitochondries. De plus, l’interaction de l’ORP5-ORP8 PLA au niveau des contacts de la membrane plasmique ER dans un site de contact à trois voies entre les mitochondries, le RE et les gouttelettes lipidiques est identifiée à l’aide de cellules HeLa transfectées avec PHPLCD-RFP ou mCherry-PLN1. Comme dans toute méthode d’analyse d’image, la qualité de l’image est un point clé, l’optimisation du signal est donc déterminante pour la détection automatique des objets.
Cette technique peut également être utilisée pour étudier les associations entre deux ou plusieurs organites cellulaires, comme nous l’avons fait dans notre récente étude sur la fonction ORP5 et ORP8 au niveau des sites de contact tripartite ER, mitochondries, gouttelettes lipidiques. Cette technique peut être utile dans d’autres études dans le domaine de la communication intracellulaire pour identifier de nouvelles associations inter-organites multipartites.
