Наш протокол PLA позволяет идентифицировать и количественно оценить эндогенные взаимодействия между белками в местах контакта с мембраной. Мы использовали его для изучения взаимодействия между двумя белками эндоплазматического ретикулума в митохондриальных контактах эндоплазматического ретикулума. Этот метод сочетает в себе PLA с окрашиванием органелл и анализом расстояний между органеллами.
Это позволяет локализовать и количественно оценить взаимодействие между белками в местах контакта мембран между органеллами. После проведения анализа с помощью бесконтактного лигирования (PLA) и получения изображений настройте программное обеспечение для анализа клеток для запуска MATLAB и запустите расширение, щелкнув опцию Imaris в операционной системе Mac или меню редактирования в Windows. Выберите настройки, перейдите на панель пользовательских инструментов и задайте путь.
Чтобы импортировать изображения в программное обеспечение, преобразуйте изображения конфокального стека в файл IMS либо непосредственно через раздел арены, либо с помощью автономного конвертера файлов, который позволяет выполнять пакетное преобразование. После импорта нажмите кнопку «Редактировать», перейдите в свойства изображения и выберите геометрию изображения, чтобы проверить калибровку изображения. Убедитесь, что размер воксела соответствует размеру пикселя, ожидаемому для фактического изображения в X и Y, и шаг, применяемый микроскопом для создания стека Z, в Z.To настроить контрастность различных каналов, нажмите кнопку «Изменить» в меню, перейдите к настройке дисплея и выберите «Показать настройку дисплея».
Настройте каждый канал независимо, чтобы оптимизировать отображение каждого цвета. Этот шаг необходим для установки точных пороговых значений или обнаружения слабых объектов. Затем нажмите кнопку «Редактировать» и выберите «Обрезать 3D», чтобы ограничить анализ одной ячейкой, обрезав изображение.
Чтобы проанализировать другую ячейку в том же поле зрения, снова откройте то же изображение и обрежьте его по-другому. Детектируйте сигналы PLA, генерируемые в месте взаимодействия ORP5 и ORP8, нажав на опцию добавления новых точек, которая создает новый набор объектов и открывает мастер обнаружения пятен. Выберите канал, на котором должно выполняться точечное обнаружение.
Отрегулируйте предполагаемый диаметр XY, чтобы помочь алгоритму обнаружения пятен найти интересующие объекты. Если выбранное значение слишком велико, близлежащие объекты будут сливаться, а если значение слишком мало, могут быть обнаружены аберрантные сигналы. Теперь нажмите на вычитание фона, чтобы удалить фон изображения перед обнаружением пятна, чтобы усилить локальный контраст вокруг интересующих объектов.
Отрегулируйте порог обнаружения пятен, сохранив качество в качестве порогового параметра в программном автоматическом пороге, или немного измените это значение, чтобы обнаружить все объекты. После завершения обнаружения пятен сохраните параметры обнаружения и повторно используйте их для обработки других изображений. Затем определите митохондриальную сеть, чтобы создать визуализацию поверхности, щелкнув «Добавить новые поверхности», чтобы создать новый объект, и откройте мастер обнаружения поверхности.
Выберите канал, на котором должно быть выполнено создание поверхности. Примените фильтр по Гауссу, чтобы получить более гладкую поверхность, установив флажок сглаживания и установив пороговое значение, указывающее на мелкие детали, наблюдаемые на поверхности. После этого выполните вычитание фона, чтобы усилить локальные контрасты, и отрегулируйте порог для обнаружения митохондриальной сети на основе интенсивности сигнала.
Примените фильтр к поверхности, чтобы удалить небольшие остатки из порога, выбрав количество вокселей фильтра в окне классификации поверхности, и поиграйте с верхним и нижним порогами, чтобы оставить только интересующие объекты. После завершения создания поверхности сохраните параметры создания и повторно используйте их для обработки других изображений. Чтобы создать карту расстояний за пределами созданной митохондриальной поверхности, выберите поверхность митохондрий в окне дерева сцены.
Щелкните обработку изображений и выберите функцию поверхностей с последующим преобразованием расстояния. Появится расширение MATLAB, предлагающее пользователю выбрать, должна ли карта вычисляться снаружи или внутри поверхности объекта. Выберите объект внешней поверхности для измерения расстояния между пятнами PLA и поверхностью митохондрий.
После того, как карта будет сгенерирована, она появится как новый канал на панели настройки отображения. В этом канале каждый пиксель имеет значение, соответствующее расстоянию до ближайшей митохондрии. Выберите точки, ранее созданные в дереве сцены, чтобы измерить расстояние от каждой точки до ближайшей митохондрии, а также определить и визуализировать ближайшие из них.
Теперь выберите конкретные значения и интенсивность центра канала, соответствующие карте расстояний в статистике и подробном журнале, чтобы измерить значение центра каждой точки, которое соответствует его расстоянию до ближайшей к митохондрии на карте расстояний. Экспортируйте данные в виде CSV-файла, нажав на значок дискеты в левом нижнем углу окна. Чтобы извлечь подпопуляцию пятен на основе их расстояний до митохондрий, выберите точки в дереве сцены и нажмите на вкладку фильтров.
Добавьте новый фильтр, основанный на интенсивности центра канала, соответствующего карте расстояний в этом окне, и извлеките пятна на расстоянии менее 380 нанометров от митохондрий, установив нижний порог на ноль микрометров и верхний порог на 0,380 микрометра. Выполните шаг дублирования, нажав кнопку дублирования выделения в новых местах, чтобы сфокусироваться на выбранных местах. Конфокальные изображения эндогенного ORP5-ORP8 PLA показали взаимодействие в клетках HeLa в ретикулярных ER, кортикальных ER и ER субдоменах ER в тесном контакте с митохондриями, обычно называемых митохондриально-ассоциированными ER-мембранами.
Анализ 3D-визуализации показал, что около 50% эндогенных взаимодействий ORP5-ORP8 PLA были обнаружены на митохондриально-ассоциированных мембранах ER. Процент ORP5-ORP8 PLA взаимодействий, происходящих на митохондриях-ассоциированных мембранах ER в клетках, совместно экспрессирующих ORP5 и ORP8, был аналогичен тому, который наблюдался в клетках, где эти белки экспрессировались на эндогенных уровнях. Даунрегуляция ORP5 и ORP8 индуцировала массовое снижение общего числа сигналов PLA, в то время как их ко-гиперэкспрессия увеличивала PLA.
Сигналы PLA были обнаружены в парах ORP5-PTPIP51 и ORP8-PTPIP51, и их среднее количество было аналогично паре ORP5-ORP8 PLA, что подтверждает локализацию ORP5 и ORP8 в местах контакта мембран ER-митохондрий. Кроме того, взаимодействие ORP5-ORP8 PLA на контактах плазматической мембраны ER в трехстороннем контакте между митохондриями, ER и липидными каплями идентифицируется с помощью клеток HeLa, трансфицированных PHPLCD-RFP или mCherry-PLN1. Как и в любом методе анализа изображений, качество изображения является ключевым моментом, поэтому оптимизация сигнала имеет решающее значение для автоматического обнаружения объектов.
Этот метод также может быть использован для изучения ассоциаций между двумя или несколькими клеточными органеллами, как это было сделано в нашем недавнем исследовании функции ORP5 и ORP8 в трехсторонних контактных сайтах ER, митохондрий и липидных капель. Этот метод может быть полезен в других исследованиях в области внутриклеточной коммуникации для выявления новых многосоставных межорганелльных ассоциаций.
