PLA protokolümüz, membran temas bölgelerindeki proteinler arasındaki endojen etkileşimi tanımlamaya ve ölçmeye izin verir. Endoplazmik retikulum mitokondriyal temas bölgelerinde iki endoplazmik retikulum proteini arasındaki etkileşimi incelemek için kullandık. Bu teknik, PLA'yı organel boyamaları ve organellerin mesafelerinin analizi ile birleştirir.
Organeller arası membran temas bölgelerindeki proteinler arasındaki etkileşimde lokalize ve nicelleştirmeye izin verir. Yakınlık ligasyon tahlili veya PLA ve görüntü alma işlemini gerçekleştirdikten sonra, hücre analizi yazılımını MATLAB'ı başlatacak şekilde ayarlayın ve Mac işletim sisteminde Imaris seçeneğini veya Windows'ta düzenleme menüsünü tıklatarak bir uzantı başlatın. Tercihleri seçin, özel araçlar paneline geçin ve yolu ayarlayın.
Görüntüleri yazılıma aktarmak için, konfokal yığın görüntülerini doğrudan arena bölümünden veya toplu dönüştürmeye izin veren bağımsız dosya dönüştürücüyü kullanarak bir IMS dosyasına dönüştürün. İçe aktarma işleminden sonra, düzenle'ye tıklayın, görüntü özelliklerine gidin ve görüntü kalibrasyonunu kontrol etmek için görüntü geometrisini seçin. Voksel boyutunun X ve Y'deki gerçek görüntü için beklenen piksel boyutuna ve farklı kanalların kontrastını ayarlamak Z.To Z yığınını oluşturmak için mikroskop tarafından uygulanan adıma karşılık gelip gelmediğini kontrol edin Menüde Düzenle'ye tıklayın, ekran ayarına gidin ve ekran ayarını göster'i seçin.
Her rengin görüntüsünü optimize etmek için her kanalı bağımsız olarak ayarlayın. Bu adım, kesin eşikler belirlemek veya zayıf nesneleri tespit etmek için gereklidir. Ardından, görüntüyü kırparak analizi tek bir hücreyle sınırlamak için düzenle'yi tıklayın ve 3D'yi kırp'ı seçin.
Aynı görüş alanındaki başka bir hücreyi analiz etmek için, aynı görüntüyü yeniden açın ve farklı şekilde kırpın. ORP5 ve ORP8 etkileşiminin bulunduğu yerde üretilen PLA sinyallerini, yeni bir nesne kümesi oluşturan ve nokta algılama sihirbazını açan yeni noktalar ekle seçeneğine tıklayarak tespit edin. Nokta algılamanın gerçekleştirileceği kanalı seçin.
Nokta algılama algoritmasının ilgilenilen nesneleri bulmasına yardımcı olmak için tahmini XY çapını ayarlayın. Seçilen değer çok yüksekse, yakındaki nesneler kaynaşır ve değer çok küçükse, anormal sinyaller algılanabilir. Şimdi, ilgilenilen nesnelerin etrafındaki yerel kontrastı artırmak için nokta algılamadan önce görüntü arka planını kaldırmak için arka plan çıkarmaya tıklayın.
Kaliteyi yazılım otomatik eşiğinde eşik parametresi olarak tutarak nokta algılama eşiğini ayarlayın veya tüm nesneleri algılamak için bu değeri biraz değiştirin. Nokta algılama bittiğinde, algılama parametrelerini kaydedin ve diğer görüntüleri işlemek için yeniden kullanın. Ardından, yeni bir nesne oluşturmak için yeni yüzeyler ekle'ye tıklayarak bir yüzey oluşturma oluşturmak için mitokondriyal ağı tespit edin ve yüzey algılama sihirbazını açın.
Yüzey oluşturma işleminin gerçekleştirileceği kanalı seçin. Daha pürüzsüz bir yüzey elde etmek için pürüzsüz onay kutusunu tıklatarak ve yüzeyde gözlemlenebilen küçük ayrıntıları gösteren bir eşik ayarlayarak Gauss filtresi uygulayın. Ardından, yerel kontrastları geliştirmek için bir arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirin ve sinyalin yoğunluğuna göre mitokondriyal ağı tespit etmek için eşiği ayarlayın.
Yüzey sınıflandırma penceresinde voksel sayısı filtresini seçerek eşikten küçük kalıntıları çıkarmak için yüzeye bir filtre uygulayın ve yalnızca ilgilenilen nesneleri tutmak için üst ve alt eşiklerle oynayın. Yüzey oluşturma işlemi bittiğinde, oluşturma parametrelerini kaydedin ve diğer görüntüleri işlemek için bunları yeniden kullanın. Oluşturulan mitokondriyal yüzeyin dışında bir mesafe haritası oluşturmak için, sahne ağacı kutusunda mitokondri yüzeyini seçin.
Görüntü işlemeye tıklayın ve yüzeyler işlevini seçin, ardından mesafe dönüşümü yapın. Kullanıcıdan haritanın nesne yüzeyinin dışında mı yoksa içinde mi hesaplanacağını seçmesini isteyen bir MATLAB uzantısı görünecektir. PLA noktaları ile mitokondri yüzeyi arasındaki mesafeyi ölçmek için dış yüzey nesnesini seçin.
Harita oluşturulduktan sonra, ekran ayarlama panelinde yeni bir kanal olarak görünür. Bu kanalda, her pikselin en yakın mitokondriye olan mesafeye karşılık gelen bir değeri vardır. Her noktadan en yakın mitokondriye olan mesafeyi ölçmek ve en yakın olanları belirlemek ve görselleştirmek için sahne ağacı kutusunda daha önce oluşturulan noktaları seçin.
Şimdi, mesafe haritasındaki mitokondriye en yakın mesafeye karşılık gelen her bir nokta merkezinin değerini ölçmek için istatistiklerde ve ayrıntılı günlükte mesafe haritasına karşılık gelen kanalın belirli değerlerini ve merkez yoğunluğunu seçin. Pencerenin sol alt kısmındaki disket simgesine tıklayarak verileri CSV dosyası olarak dışa aktarın. Mitokondriye olan mesafelerine göre bir nokta alt popülasyonu çıkarmak için, sahne ağacındaki noktaları seçin ve filtreler sekmesine tıklayın.
Bu penceredeki mesafe haritasına karşılık gelen kanalın merkez yoğunluğuna göre yeni bir filtre ekleyin ve alt eşiği sıfır mikrometreye ve üst eşiği 0,380 mikrometreye ayarlayarak mitokondriden 380 nanometreden daha az uzaklıktaki noktaları çıkarın. Seçilen noktalara odaklanmak için seçimi yeni noktalara kopyala düğmesine basarak bir çoğaltma adımı gerçekleştirin. Endojen ORP5-ORP8 PLA'nın konfokal görüntüleri, retiküler ER, kortikal ER ve ER alt alanlarındaki HeLa hücrelerinde, genellikle mitokondri ile ilişkili ER membranları olarak adlandırılan mitokondri ile yakın temas halinde etkileşimler gösterdi.
3D görüntüleme analizi, endojen ORP5-ORP8 PLA etkileşimlerinin yaklaşık% 50'sinin mitokondri ile ilişkili ER membranlarında tespit edildiğini ortaya koydu. ORP5 ve ORP8'i birlikte aşırı eksprese eden hücrelerde mitokondri ile ilişkili ER membranlarında meydana gelen ORP5-ORP8 PLA etkileşimlerinin yüzdesi, bu proteinlerin endojen seviyelerde eksprese edildiği hücrelerde gözlemlenene benzerdi. ORP5 ve ORP8 aşağı regülasyonu, toplam PLA sinyali sayısında büyük bir düşüşe neden olurken, birlikte aşırı ekspresyonları PLA'yı artırdı.
ORP5-PTPIP51 ve ORP8-PTPIP51 çiftlerinde PLA sinyalleri tespit edildi ve ortalama sayıları ORP5-ORP8 PLA çiftine benzerdi ve ER-mitokondri membran temas bölgelerinde ORP5 ve ORP8 lokalizasyonunu doğruladı. Ayrıca, ORP5-ORP8 PLA'nın mitokondri, ER ve lipid damlacıkları arasındaki üç yönlü bir temas bölgesinde ER plazma membranı temaslarında etkileşimi, PHPLCD-RFP veya mCherry-PLN1 ile transfekte edilmiş HeLa hücreleri kullanılarak tanımlanır. Herhangi bir görüntü analiz yönteminde olduğu gibi, görüntü kalitesi kilit bir noktadır, bu nedenle sinyalin optimizasyonu, nesnelerin otomatik olarak algılanması için belirleyicidir.
Bu teknik, üç taraflı ER, mitokondri, lipid damlacıkları temas bölgelerinde ORP5 ve ORP8 fonksiyonu üzerine yaptığımız son çalışmada yaptığımız gibi, iki veya çoklu hücresel organel arasındaki ilişkileri incelemek için de kullanılabilir. Bu teknik, hücre içi iletişim alanındaki diğer çalışmalarda, yeni çok parçalı organeller arası ilişkileri tanımlamak için yardımcı olabilir.
