当社のPLAプロトコルにより、膜接触部位におけるタンパク質間の内因性相互作用を同定し、定量することができます。我々は、小胞体ミトコンドリア接触部位における2つの小胞体タンパク質間の相互作用を研究するために使用しました。この技術は、PLAとオルガネラ染色およびオルガネラの距離の分析を組み合わせたものです。
これにより、オルガネラ間膜接触部位におけるタンパク質間の相互作用を局在化および定量化することができます。近接ライゲーションアッセイ(PLA)と画像取得を実行した後、細胞解析ソフトウェアを設定してMATLABを起動し、MacオペレーティングシステムのImarisオプションまたはWindowsの編集メニューをクリックして拡張機能を起動します。環境設定を選択し、カスタムツールパネルに変更して、パスを設定します。
画像をソフトウェアにインポートするには、アリーナセクションから直接、またはバッチ変換が可能なスタンドアロンのファイルコンバーターを使用して、共焦点スタック画像をIMSファイルに変換します。インポート後、編集をクリックし、画像のプロパティに移動し、画像ジオメトリを選択して画像のキャリブレーションを確認します。ボクセルサイズがXとYの実際の画像に期待されるピクセルサイズに対応していることを確認し、顕微鏡がZスタックを生成するために適用したステップを確認します Z.To さまざまなチャンネルのコントラストを調整します メニューの[編集]をクリックし、ディスプレイ調整に移動して、[ディスプレイ調整を表示]を選択します。
各チャンネルを個別に調整して、各色の表示を最適化します。このステップは、正確なしきい値を設定したり、弱い物体を検出したりするために不可欠です。次に、[編集] をクリックして [3D のトリミング] を選択し、画像をトリミングして分析を 1 つのセルに制限します。
同じ視野内の別のセルを分析するには、同じ画像をもう一度開き、別の画像を切り抜きます。ORP5とORP8の相互作用の場所で生成されたPLA信号を検出するには、[新しいスポットの追加]オプションをクリックして、新しいオブジェクトのセットを作成し、スポット検出ウィザードを開きます。スポット検出を実行するチャネルを選択します。
推定 XY 直径を調整して、スポット検出アルゴリズムが目的のオブジェクトを見つけやすくします。選択した値が高すぎると近くの物体が融合し、値が小さすぎると異常な信号が検出される可能性があります。次に、背景の減算をクリックして、スポット検出の前に画像の背景を削除し、関心のあるオブジェクトの周囲の局所的なコントラストを高めます。
ソフトウェア自動しきい値のしきい値パラメーターとして品質を維持してスポット検出しきい値を調整するか、この値を少し変更してすべてのオブジェクトを検出します。スポット検出が終了したら、検出パラメータを保存し、他の画像の処理に再利用します。次に、ミトコンドリアネットワークを検出して、新しいサーフェスの追加をクリックして新しいオブジェクトを作成し、サーフェス検出ウィザードを開き、サーフェスレンダリングを生成します。
サーフェスの作成を実行するチャネルを選択します。ガウスフィルタを適用して滑らかなサーフェスを得るには、[スムーズ]チェックボックスをクリックし、サーフェス上で観察可能な細部を示すしきい値を設定します。その後、バックグラウンド減算を実行して局所的なコントラストを強調し、シグナルの強度に基づいてミトコンドリアネットワークを検出するようにしきい値を調整します。
[サーフェスの分類] ウィンドウでボクセルの数フィルターを選択して、サーフェスにフィルターを適用して閾値から小さな残差を削除し、上限と下限の閾値を操作して、対象のオブジェクトのみを保持します。サーフェスの作成が終了したら、作成パラメータを保存し、他のイメージの処理に再利用します。作成したミトコンドリア表面の外側に距離マップを生成するには、シーンツリーボックスでミトコンドリア表面を選択します。
画像処理をクリックしてサーフェス機能を選択し、距離変換を行います。マップをオブジェクト サーフェスの外側または内側のどちらで計算するかを選択するようにユーザーに求める MATLAB 拡張機能が表示されます。外面オブジェクトを選択して、PLAスポットとミトコンドリアの表面の間の距離を測定します。
マップが生成されると、表示調整パネルに新しいチャンネルとして表示されます。このチャネルでは、すべてのピクセルに最も近いミトコンドリアまでの距離に対応する値があります。シーンツリーボックスで以前に生成されたスポットを選択して、各ポイントから最も近いミトコンドリアまでの距離を測定し、最も近いスポットを特定して視覚化します。
次に、統計と詳細ログで距離マップに対応するチャネルの特定の値と中心強度を選択して、距離マップでミトコンドリアに最も近い距離に対応する各スポット中心の値を測定します。ウィンドウの左下にあるフロッピーディスクアイコンをクリックして、データをCSVファイルとしてエクスポートします。ミトコンドリアまでの距離に基づいてスポットの亜集団を抽出するには、シーンツリーでスポットを選択し、[フィルター]タブをクリックします。
このウィンドウの距離マップに対応するチャネルの中心強度に基づいて新しいフィルターを追加し、下限をゼロマイクロメートル、上限しきい値を0.380マイクロメートルに設定して、ミトコンドリアから380ナノメートル未満のスポットを抽出します。[選択範囲を新しいスポットに複製]ボタンを押して、選択したスポットに焦点を合わせて、複製手順を実行します。内因性ORP5-ORP8 PLAの共焦点画像は、一般にミトコンドリア関連小胞体膜と呼ばれるミトコンドリアと密接している網状ER、皮質ER、および小胞体サブドメインのHeLa細胞における相互作用を示しました。
3Dイメージング分析により、内因性ORP5-ORP8 PLA相互作用の約50%がミトコンドリア関連ER膜で検出されたことが明らかになりました。ORP5とORP8を共過剰発現している細胞のミトコンドリア関連小胞体膜で生じるORP5-ORP8 PLA相互作用の割合は、これらのタンパク質が内因性レベルで発現している細胞で観察されたものと同様でした。ORP5とORP8のダウンレギュレーションはPLAシグナルの総数を大幅に減少させ、それらの共過剰発現はPLAを増加させました。
PLAシグナルはORP5-PTPIP51およびORP8-PTPIP51カップルで検出され、それらの平均数はORP5-ORP8 PLAカップルと同様であり、ER-ミトコンドリア膜接触部位でのORP5およびORP8の局在が確認されました。さらに、ミトコンドリア、小胞体、および脂肪滴の間の三者接触部位における小胞体原形質膜接触におけるORP5-ORP8 PLAの相互作用は、PHPLCD-RFPまたはmCherry-PLN1を導入したHeLa細胞を用いて同定される。他の画像解析方法と同様に、画質が重要なポイントであるため、信号の最適化はオブジェクトの自動検出にとって決定的です。
この手法は、ER、ミトコンドリア、脂肪滴の3者接触部位におけるORP5およびORP8機能に関する最近の研究で行ったように、2つまたは複数の細胞小器官間の関連を研究するためにも使用できます。この手法は、細胞内コミュニケーション分野の他の研究で、新しい多者間オルガネラ間会合を特定するのに役立ちます。
