我们演示了使用模拟监督机器学习工具来分析固定细胞荧光显微镜图像中的线粒体。目前在显微镜图像中分割线粒体的方法包括基于自动阈值的方法，例如Ostu或手动分割。基于阈值的技术在信噪比较低的情况下表现不佳。
通常，用于形态学分析的图像具有大量线粒体，这使得手动分割变得乏味。监督式深度学习方法以高精度执行分割，但需要大量输入真实数据进行训练。这种方法使用基于物理的模拟器生成成对的显微镜图像及其2D真实形状掩模，从而消除了手动注释的需要。
然后，在模拟图像上训练的模型用于分割真实显微镜图像中的线粒体。我们使用基于深度学习的分割工具，该工具能够以高精度实现此任务的自动化，并且不需要带注释的地面真实数据集进行训练。仿真从使用参数化曲线生成几何图形开始，以生成形状。
发射器均匀分布并随机放置在生成的形状的表面上，以使密度与实验值匹配。显微镜的3D PSF使用Gibson-Lanni模型计算。为了在模拟图像和实验图像之间实现逼真的效果，我们模拟了黑暗和散粒噪声。
物理地面真相以二进制映射的形式生成。我们评估了CCCP治疗对使用共聚焦显微镜成像的固定心肌母细胞线粒体形态的影响。细胞培养。
通过在12孔板的孔中为每个实验条件放置盖玻片，准备在无菌层流罩中操作细胞接种。在向每个孔分配适当体积之前，将离心管的内容物上下移液数次，确保稀释的细胞悬液正确混合。实验程序。
从12孔板的孔中吸出细胞培养基，然后快速将新鲜的预热培养基涂覆到对照孔中，并将带有10微摩尔CCCP溶液的预热培养基涂覆到测试条件孔中。在 37 摄氏度的细胞培养箱中孵育两个小时。从孔中吸出细胞培养基并应用预热的固定溶液。
在盖玻片上染色和安装细胞。将 10 微升安装介质添加到准备好的载玻片中以安装盖玻片。用镊子从 12 孔板上拿起盖玻片，将盖玻片的边缘和背面短暂接触到准备好的不起毛纸巾上，轻拍盖玻片上的水分。
轻轻地将盖玻片放在等待的封片介质液滴上。显微镜和成像。使用目镜手动调整Z水平以使样品聚焦。
切换到软件中获取的选项卡。使用智能设置选择要用于成像的荧光通道。阵列以盖玻片中间为中心，总共有 12 个要成像的位置。
将 RA 放置在盖玻片的中心位置。可以自动对多个位置进行成像。生成模拟训练数据。
下载代码并解压缩内容。按照说明和自述文件设置环境。导航到名为 src“制作副本或使用文件夹 2.
线粒体模拟通风“并重命名。此文件夹包含与训练数据模拟相关的所有文件。要为模拟设置三组参数。
首先，在批处理配置文件中设置模拟器的线粒体数量、直径范围、Z轴范围和荧光团密度等参数。接下来，在文件显微镜PSFmode中设置数据集的数值孔径，放大倍率和最小波长的光学参数。py“在火generate_batch_parallel中设置像素大小和发射波长的所需值。
py“设置有关输出数据集的第三组参数，例如输出图像的大小、每个图像中的切片数以及文件generate_batch_parallel中的总图像数。py“generate_batch_parallel运行文件。py“开始模拟。
若要获取最终大小的图像，请创建名为 5 的文件夹的副本。数据准备和培训/数据准备“并导航到其中。设置批号参数和每批图像数，要在文件Data_generator中添加的噪声范围。
py“Data_generator运行文件。py“创建蒙太奇图像。将名为 image“和 segment”的文件夹复制到数据训练/训练“文件夹中。
基于深度学习的分割。要为新的显微镜图像设置训练分割模型，请导航到名为 train“的文件夹，并在名为 train_unet 的文件中设置巴赫大小、分割的主干模型、周期数和训练学习率的参数。py“train_unet运行文件。
py“开始训练。训练过程显示用于评估模拟验证集上的分段模型的指标。训练完成后，模型将另存为best_model。
h5“在名为 train 的文件夹中”要在显微镜图像上测试模型，必须将图像拆分为训练模型所需的大小。为此，请导航到名为 6 的文件夹。准备测试数据“并将数据的PNG格式文件复制到文件夹PNG”并运行文件split_1024_256。
py“这将在数据文件夹中创建 256 x 256 大小的图像裁剪。要分割图像裁剪，请转到名为 7 的文件夹。测试分段“并运行名为分段的文件。
py“设置要使用的已保存模型的名称后。分割后的图像将保存到输出文件夹中。形态学分析。
放置名为 make_montage 的文件。py“放入名为 7 的文件夹中。测试分割“并运行文件以将分割后的输出拼接回图像的原始大小。
创建一个名为 9 的新文件夹。形态分析“在源文件夹中并导航到它。使用命令安装 skan 和 seaborn 库 pip 安装 seaborn skan“分割掩码使用名为 skan 的库进行骨架化”以分析单个线粒体的拓扑。
将文件放入文件夹 9。形态分析“将实验不同组的图像排列到文件夹7内的不同文件夹中。测试分段“运行文件以创建用于分析的图。结果。
要执行的定量分析取决于研究问题或假设。在我们的实验中，我们对线粒体的三种不同形态感兴趣，即点“小线粒体位，棒状”纤维状或弦状线粒体，以及多分支网络“为了识别形态，我们首先对分割输出进行骨架化并分析不同类别的分支链接。我们显示了两组半乳糖适应细胞的分析结果，对照组和CCCP处理组。
我们看到点的平均分支长度显着增加，这是意料之中的，因为线粒体在暴露于CCCP时会肿胀。当用CCCP处理细胞时，线粒体在杆细胞和网络类别的个体长度中的百分比相对于对照显着降低，从而验证了我们的假设。对于我们的方法来说，一个具有挑战性的情况是当图像具有密集的线粒体时。
粉红色表示图像中检测到的最长的单个线粒体，这是由于分割结果中的误差增加造成的。这些故障情况可以通过控制线粒体的长度和使用形态学运算符来检测。虽然我们的应用是我们如何进行线粒体形态分析的一个例子，但我们相信，围绕它的分析和研究问题可以针对线粒体自噬和相关生物学实验的各个方面制定。
