نوضح استخدام أداة التعلم الآلي الخاضعة للإشراف على المحاكاة لتحليل الميتوكوندريا في صور الفحص المجهري الفلوري للخلايا الثابتة. تتضمن الطرق الحالية لتقسيم الميتوكوندريا في صور الفحص المجهري طرقا تلقائية تعتمد على العتبة مثل Ostu أو التجزئة اليدوية. تعمل التقنيات القائمة على العتبة بشكل سيئ حيث تكون نسبة الإشارة إلى الخلفية منخفضة.
عادة ، تتميز صور التحليل المورفولوجي بعدد كبير من الميتوكوندريا ، مما يجعل التجزئة اليدوية مملة. تؤدي طرق التعلم العميق الخاضعة للإشراف التجزئة بدقة عالية ، ولكنها تتطلب عددا كبيرا من بيانات زوج الحقيقة الأرضية للتدريب. يستخدم هذا النهج محاكيا قائما على الفيزياء لتوليد أزواج من الصور المجهرية ، وقناع شكل الحقيقة الأرضية 2D ، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى التعليق التوضيحي اليدوي.
ثم يتم استخدام النموذج المدرب على الصور المحاكاة لتقسيم الميتوكوندريا في صور مجهر حقيقية. نحن نستخدم أداة تجزئة قائمة على التعلم العميق تتيح أتمتة هذه المهمة بدقة عالية ولا تتطلب مجموعة بيانات حقيقة أرضية مشروحة للتدريب. تبدأ المحاكاة بتوليد الهندسة باستخدام منحنيات حدودية لتوليد الشكل.
يتم توزيع البواعث بشكل موحد ووضعها عشوائيا على سطح الشكل المتولد بحيث تتطابق الكثافة مع القيم التجريبية. يتم حساب 3D PSF من المجهر باستخدام نموذج جيبسون لاني. لتحقيق واقعية الصورة بين الصور المحاكاة والصور التجريبية ، نقوم بمحاكاة كل من الضوضاء المظلمة والنارية.
يتم إنشاء الحقيقة الأرضية الفيزيائية في شكل خريطة ثنائية. نقوم بتقييم تأثير علاج CCCP على مورفولوجيا الميتوكوندريا للخلايا العضلية القلبية الثابتة التي تم تصويرها باستخدام مجهر متحد البؤر. ثقافة الخلية.
استعد لبذر الخلايا ، التي تعمل في غطاء تدفق رقائقي معقم ، عن طريق وضع زلة غطاء لكل حالة تجريبية في بئر من 12 لوحة بئر. تأكد من خلط تعليق الخلية المخفف بشكل صحيح عن طريق سحب محتويات أنبوب الطرد المركزي لأعلى ولأسفل عدة مرات قبل توزيع الحجم المناسب لكل بئر. إجراء تجريبي.
قم بشفط وسائط زراعة الخلايا من آبار لوحة البئر 12 ثم قم بتطبيق الوسائط المسخنة مسبقا الطازجة بسرعة على آبار التحكم والوسائط المسخنة مسبقا بمحلول CCCP 10 ميكرومولار على آبار حالة الاختبار. احتضان في حاضنة الخلية 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. قم بشفط وسائط زراعة الخلايا من الآبار وقم بتطبيق محلول التثبيت المسخن مسبقا.
تلطيخ وتركيب الخلايا على زلات الغطاء. أضف وسائط تركيب سعة 10 ميكرولتر إلى شريحة زجاجية معدة لتركيب زلة غطاء. التقط زلة الغطاء من لوحة البئر 12 باستخدام ملاقط ومسح الرطوبة من زلات الغطاء عن طريق لمس الحافة لفترة وجيزة والجزء الخلفي من زلة الغطاء بالمنشفة الورقية الخالية من النسالة المعدة.
اخفض الغطاء برفق على قطرة الانتظار لوسائط التثبيت. المجهر والتصوير. باستخدام المنظار ، اضبط مستوى Z يدويا لتركيز العينة.
قم بالتبديل إلى علامة التبويب المكتسبة داخل البرنامج. استخدم الإعداد الذكي لتحديد قناة مضان لاستخدامها في التصوير. تتمحور الصفيف في منتصف زلة الغطاء مع إجمالي 12 موضعا ليتم تصويرها.
تمركز موضع RA في وسط قسيمة الغطاء. من الممكن تصوير مواقع متعددة بطريقة آلية. توليد بيانات تدريب محاكاة.
قم بتنزيل الرمز وفك ضغط المحتويات. اتبع الإرشادات والملف التمهيدي لإعداد البيئة. انتقل إلى المجلد المسمى src"إنشاء نسخة أو استخدام المجلد 2.
محاكاة الميتوكوندريا متجدد الهواء"وإعادة تسميته. يحتوي هذا المجلد على جميع الملفات المتعلقة بمحاكاة بيانات التدريب. هناك ثلاث مجموعات من المعلمات التي سيتم تعيينها للمحاكاة.
أولا ، قم بتعيين معلمات عدد الميتوكوندريا ، ونطاق القطر ، ونطاق المحور Z ، وكثافة الفلوروفورات للمحاكاة في ملف التكوين الدفعي. بعد ذلك ، قم بتعيين المعلمات البصرية للفتحة العددية والتكبير والحد الأدنى للطول الموجي لمجموعة البيانات في مجهر الملفPSFmode. py "اضبط القيمة المطلوبة لحجم البكسل والطول الموجي للانبعاث في generate_batch_parallel النار.
py"قم بتعيين المجموعة الثالثة من المعلمات المتعلقة بمجموعة بيانات الإخراج ، مثل حجم الصور الناتجة وعدد التجانبات في كل صورة وعدد الصور الإجمالية في generate_batch_parallel الملف. py"تشغيل الملف generate_batch_parallel. py"لبدء المحاكاة.
للحصول على صورة الحجم النهائي ، قم بعمل نسخة من المجلد المسمى 5. إعداد البيانات والتدريب / إعداد البيانات "والتنقل فيها. قم بتعيين معلمات رقم الدفعة وعدد الصور لكل دفعة ، ونطاق الضوضاء المراد إضافته في Data_generator الملف.
py"قم بتشغيل الملف Data_generator. py"إنشاء صور المونتاج. انسخ المجلدات المسماة الصورة "والجزء" إلى مجلد datatrain / train".
التجزئة القائمة على التعلم العميق. لتدريب نموذج التجزئة لإعداد صورة مجهر جديد ، انتقل إلى المجلد المسمى Train "وقم بتعيين معلمات حجم bach ونموذج العمود الفقري للتجزئة وعدد العصور ومعدل التعلم للتدريب داخل الملف المسمى train_unet. py"تشغيل الملف train_unet.
py"لبدء التدريب. تعرض عملية التدريب مقياس تقييم نموذج التجزئة على مجموعة التحقق من الصحة المحاكاة. بعد اكتمال التدريب ، يتم حفظ النموذج ك best_model.
h5"في المجلد المسمى القطار"لاختبار النموذج على صور المجهر ، يجب تقسيم الصور إلى الحجم المرغوب فيه بواسطة نموذج القطار. لهذا ، انتقل إلى المجلد المسمى 6. قم بإعداد بيانات الاختبار "وانسخ ملفات تنسيق PNG للبيانات في المجلد PNG" وقم بتشغيل الملف split_1024_256.
py "سيؤدي هذا إلى إنشاء 256 × 256 محصولا بحجم الصور في مجلد البيانات. لتقسيم اقتصاص الصور، انتقل إلى المجلد المسمى 7. اختبار تجزئة "وتشغيل الملف المسمى المقطع.
py"بعد تعيين اسم النموذج المحفوظ المراد استخدامه. يتم حفظ الصور المجزأة في مجلد الإخراج. التحليل المورفولوجي.
ضع الملف المسمى make_montage. py"في المجلد المسمى 7. اختبار التجزئة "وتشغيل الملف لغرز الإخراج المجزأ مرة أخرى إلى الحجم الأصلي للصورة.
إنشاء مجلد جديد باسم 9. التحليل المورفولوجي"في المجلد المصدر وانتقل إليه. قم بتثبيت مكتبات skan و seaborn باستخدام الأمر pip install seaborn skan "أقنعة التجزئة هيكلية باستخدام المكتبة المسماة skan" لتمكين تحليل طوبولوجيا الميتوكوندريا الفردية.
ضع الملف في المجلد 9. التحليل المورفولوجي"رتب صور مجموعات مختلفة من التجربة في مجلدات مختلفة داخل المجلد 7. اختبار تجزئة "قم بتشغيل الملف لإنشاء مؤامرات للتحليل. النتائج.
يعتمد التحليل الكمي الذي يتعين إجراؤه على أسئلة البحث أو الفرضية. في تجربتنا ، كنا مهتمين بالأشكال الثلاثة المختلفة للميتوكوندريا ، وهي النقاط "بتات الميتوكوندريا الصغيرة ، والقضبان" الشبيهة بالألياف أو الخيط مثل الميتوكوندريا ، والشبكات متعددة الفروع"لتحديد التشكل ، نقوم أولا بهيكلة مخرجات التجزئة وتحليل الروابط الفرعية للفئات المختلفة. نعرض نتائج التحليل لمجموعتي الخلايا المتكيفة مع الجالاكتوز ، المجموعة الضابطة والمجموعة المعالجة ب CCCP.
نرى زيادة كبيرة في متوسط أطوال الفروع للنقاط ، وهو أمر متوقع ، نظرا لتورم الميتوكوندريا عند تعرضها ل CCCP. يتم تقليل النسبة المئوية للميتوكوندريا في الأطوال الفردية لكل من القضبان وفئات الشبكة بشكل كبير بالنسبة إلى عنصر التحكم عندما يتم علاج الخلايا باستخدام CCCP ، وبالتالي التحقق من فرضيتنا. السيناريو الصعب لطريقتنا هو عندما تكون الصورة مكتظة بالميتوكوندريا.
يشير اللون الوردي إلى أطول ميتوكوندريون مفرد تم اكتشافه في الصورة ، والذي يحدث بسبب زيادة الخطأ في نتائج التجزئة. يمكن اكتشاف حالات الفشل هذه عن طريق التحكم في أطوال الميتوكوندريا واستخدام العوامل المورفولوجية. في حين أن تطبيقنا هو مثال على كيفية إجراء تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا ، فإننا نعتقد أن مثل هذا التحليل وأسئلة البحث حوله يمكن صياغتها لجوانب مختلفة من الميتوفاجي والتجارب البيولوجية ذات الصلة.
