Dimostriamo l'uso di uno strumento di apprendimento automatico supervisionato dalla simulazione per analizzare i mitocondri in immagini al microscopio fluorescente di cellule fisse. I metodi attuali per segmentare i mitocondri nelle immagini al microscopio includono metodi basati sulla soglia automatica come Ostu o segmentazione manuale. Le tecniche basate sulla soglia funzionano male dove il rapporto segnale/sfondo è basso.
Tipicamente, le immagini per l'analisi morfologica presentano un gran numero di mitocondri, rendendo noiosa la segmentazione manuale. I metodi di deep learning supervisionati eseguono la segmentazione con elevata precisione, ma richiedono un gran numero di dati di coppia base-verità di input per l'addestramento. Questo approccio utilizza un simulatore basato sulla fisica per generare coppie di immagini al microscopio e la loro maschera di forma 2D ground-truth, eliminando così la necessità di annotazioni manuali.
Il modello addestrato su immagini simulate viene quindi utilizzato per segmentare i mitocondri in immagini al microscopio reali. Utilizziamo uno strumento di segmentazione basato sul deep learning che consente l'automazione di questa attività con elevata precisione e che non richiede un set di dati di verità di base annotato per l'addestramento. La simulazione inizia con la generazione della geometria utilizzando curve parametriche per la generazione di forme.
Gli emettitori sono distribuiti uniformemente e posizionati casualmente sulla superficie della forma generata in modo tale che la densità corrisponda ai valori sperimentali. Una PSF 3D del microscopio viene calcolata utilizzando il modello Gibson-Lanni. Per ottenere il fotorealismo tra le immagini simulate e le immagini sperimentali, emuliamo sia i rumori scuri che quelli ripresi.
La verità di base della fisica è generata sotto forma di una mappa binaria. Valutiamo l'effetto del trattamento con CCCP sulla morfologia dei mitocondri dei cardiomioblasti fissi ripresi utilizzando un microscopio confocale. Coltura cellulare.
Prepararsi per la semina delle cellule, operando in una cappa a flusso laminare sterile, posizionando un vetrino di copertura per ogni condizione sperimentale in un pozzetto di una piastra da 12 pozzetti. Assicurarsi che la sospensione della cella diluita sia miscelata correttamente pipettando il contenuto della provetta della centrifuga su e giù più volte prima di erogare il volume appropriato a ciascun pozzetto. Procedura sperimentale.
Aspirare i terreni di coltura cellulare dai pozzetti della piastra a 12 pozzetti, quindi applicare rapidamente nuovi mezzi preriscaldati ai pozzetti di controllo e i mezzi preriscaldati con soluzione CCCP a 10 micromolari ai pozzetti di prova. Incubare nell'incubatore cellulare da 37 gradi Celsius per due ore. Aspirare i terreni di coltura cellulare dai pozzetti e applicare la soluzione di fissazione preriscaldata.
Colorazione e montaggio di celle su vetrini di copertura. Aggiungere un supporto di montaggio da 10 microlitri a un vetrino preparato per montare una vetrina. Raccogliere il foglietto di copertura dalla piastra a 12 pozzetti usando una pinzetta e tamponare l'umidità dai vetrini di copertura toccando brevemente il bordo e il retro del foglietto di copertura sul tovagliolo di carta privo di lanugine preparato.
Abbassare delicatamente la slitta del coperchio sulla goccia di attesa del supporto di montaggio. Microscopio e imaging. Utilizzando gli oculari, regolare manualmente il livello Z per mettere a fuoco il campione.
Passare alla scheda acquisita all'interno del software. Utilizzare la configurazione intelligente per selezionare il canale di fluorescenza da utilizzare per l'imaging. Centrato sull'array al centro della copertina con 12 posizioni totali da fotografare.
Posizione RA centrata al centro della vetrina. È possibile visualizzare più posizioni in modo automatizzato. Generazione di dati di addestramento simulati.
Scarica il codice e decomprimi il contenuto. Seguire le istruzioni e il file Leggimi per configurare l'ambiente. Passare alla cartella denominata src"Fai una copia o usa la cartella 2.
simulazione mitocondri arioso" e rinominarlo. Questa cartella contiene tutti i file relativi alla simulazione dei dati di addestramento. Ci sono tre serie di parametri da impostare per la simulazione.
Innanzitutto, impostare i parametri del numero di mitocondri, intervallo di diametro, intervallo di asse Z e densità di fluorofori per il simulatore nel file di configurazione batch. Quindi, impostare i parametri ottici di apertura numerica, ingrandimento e lunghezza d'onda minima del set di dati nel microscopio filePSFmode. py"Imposta il valore desiderato per la dimensione dei pixel e la lunghezza d'onda di emissione nel generate_batch_parallel di fuoco.
py"Imposta il terzo set di parametri relativi al set di dati di output, come la dimensione delle immagini di output, il numero di tessere in ciascuna immagine e il numero di immagini totali nel file generate_batch_parallel. py"Esegui il file generate_batch_parallel. py"per avviare la simulazione.
Per ottenere l'immagine di dimensioni finali, creare una copia della cartella denominata 5. Preparazione dei dati e formazione/preparazione dei dati" e naviga all'interno. Impostare i parametri del numero di lotto e il numero di immagini per batch, intervallo di rumore da aggiungere nel file Data_generator.
py"Esegui il file Data_generator. py"Crea le immagini di montaggio. Copiare le cartelle denominate image"e segmentare"nella cartella datatrain/train".
Segmentazione basata sul deep learning. Per addestrare il modello di segmentazione per una nuova impostazione dell'immagine del microscopio, passare alla cartella denominata train" e impostare i parametri di dimensione di bach, modello di dorsale per la segmentazione, il numero di epoche e il tasso di apprendimento per l'addestramento all'interno del file denominato train_unet. py"Esegui il file train_unet.
py"per iniziare la formazione. Il processo di addestramento visualizza la metrica per valutare il modello di segmentazione sul set di convalida simulato. Al termine dell'addestramento, il modello viene salvato come best_model.
h5"nella cartella denominata train"Per testare il modello sulle immagini del microscopio, le immagini devono essere suddivise nella dimensione desiderata dal modello del treno. Per questo, vai alla cartella denominata 6. Prepara i dati di prova" e copia i file in formato PNG dei dati nella cartella PNG" ed esegui il file split_1024_256.
py"Questo creerà 256 per 256 ritagliamenti di dimensioni delle immagini nella cartella dei dati. Per segmentare i ritagli di immagini, vai alla cartella denominata 7. Test segmentation" ed eseguire il file denominato segment.
py"dopo aver impostato il nome del modello salvato da utilizzare. Le immagini segmentate vengono salvate nella cartella di output. Analisi morfologica.
Inserire il file denominato make_montage. py"nella cartella denominata 7. Test segmentation" ed eseguire il file per ricucire l'output segmentato alle dimensioni originali dell'immagine.
Creare una nuova cartella denominata 9. Analisi morfologica" nella cartella di origine e navigare al suo interno. Installare le librerie skan e seaborn utilizzando il comando pip install seaborn skan"Le maschere di segmentazione sono scheletrate utilizzando la libreria denominata skan" per consentire l'analisi della topologia del singolo mitocondrio.
Inserire il file nella cartella 9. Analisi morfologica"Disporre le immagini di diversi gruppi dell'esperimento in diverse cartelle all'interno della cartella 7. Segmentazione del test"Eseguire il file per creare grafici per l'analisi. Risultati.
L'analisi quantitativa da eseguire dipende dalle domande o dalle ipotesi di ricerca. Nel nostro esperimento, eravamo interessati alle tre diverse morfologie dei mitocondri, vale a dire punti"piccoli bit di mitocondri, bastoncelli" simili a fibre o stringhe come mitocondri e reti multi ramificate"Per identificare la morfologia, prima scheletrizziamo l'output di segmentazione e analizziamo i collegamenti di ramificazione delle diverse classi. Mostriamo i risultati dell'analisi per i due gruppi di cellule adattate alle galattosi, il gruppo di controllo e il gruppo trattato con CCCP.
Vediamo un aumento significativo delle lunghezze medie dei rami dei punti, che è previsto, dato il gonfiore che i mitocondri subiscono quando esposti al CCCP. La percentuale di mitocondri nelle singole lunghezze di entrambi i bastoncelli e le classi di rete è significativamente ridotta rispetto al controllo quando le cellule sono state trattate con CCCP, verificando così la nostra ipotesi. Uno scenario impegnativo per il nostro metodo è quando l'immagine ha mitocondri densamente impacchettati.
Il colore rosa indica il singolo mitocondrio più lungo rilevato nell'immagine, che è causato dall'aumento dell'errore nei risultati della segmentazione. Questi casi di fallimento possono essere rilevati da un controllo delle lunghezze dei mitocondri e utilizzando operatori morfologici. Mentre la nostra applicazione è un esempio di come abbiamo eseguito l'analisi della morfologia mitocondriale, riteniamo che tale analisi e domande di ricerca intorno ad essa possano essere formulate per vari aspetti della mitofagia e relativi esperimenti biologici.
