固定細胞の蛍光顕微鏡画像中のミトコンドリアを解析するためのシミュレーション教師あり機械学習ツールの使用を実証します。顕微鏡画像中のミトコンドリアをセグメント化する現在の方法には、Osteまたは手動セグメンテーションなどの自動閾値ベースの方法が含まれます。閾値ベースの手法は、信号対バックグラウンド比が低い場合、パフォーマンスが低下します。
通常、形態素解析用の画像には多数のミトコンドリアが含まれているため、手作業によるセグメンテーションは面倒です。教師ありディープラーニング手法は、高精度でセグメンテーションを実行しますが、トレーニングには多数の入力グラウンドトゥルースペアデータが必要です。このアプローチでは、物理ベースのシミュレータを使用して顕微鏡画像のペアと、その2Dグラウンドトゥルース形状マスクを生成するため、手動で注釈を付ける必要がありません。
次に、シミュレートされた画像でトレーニングされたモデルを使用して、実際の顕微鏡画像でミトコンドリアをセグメント化します。ディープラーニングベースのセグメンテーションツールを使用して、このタスクを高精度で自動化でき、トレーニングに注釈付きのグラウンドトゥルースデータセットを必要としません。シミュレーションは、形状生成にパラメトリックカーブを使用したジオメトリ生成から始まります。
エミッタは均一に分布し、密度が実験値と一致するように、生成された形状の表面にランダムに配置されます。顕微鏡の3D PSFは、ギブソン-ラニモデルを使用して計算されます。シミュレーション画像と実験画像の間でフォトリアリズムを実現するために、ダークノイズとショットノイズの両方をエミュレートします。
物理グラウンドトゥルースは、バイナリマップの形で生成されます。共焦点顕微鏡で画像化した固定心筋芽細胞のミトコンドリア形態に対するCCCP治療の効果を評価します。細胞培養。
細胞を播種するための準備をし、滅菌層流フード内で操作し、各実験条件のカバースリップを12ウェルプレートのウェルに配置する。適切な量を各ウェルに分注する前に、遠沈管の内容物を数回上下にピペッティングして、希釈した細胞懸濁液が適切に混合されていることを確認します。実験手順。
次に、12ウェルプレートのウェルから細胞培養培地を吸引し、新鮮な予熱培地をコントロールウェルにすばやく適用し、予熱した培地を10マイクロモルCCCP溶液とともに試験条件ウェルに塗布します。摂氏37度のセルインキュベーターで2時間インキュベートします。ウェルから細胞培養培地を吸引し、予熱した固定液を塗布します。
カバースリップへの細胞の染色と取り付け。準備したスライドガラスに10マイクロリットルの封入剤を追加して、カバースリップを取り付けます。ピンセットを使用して12ウェルプレートからカバースリップを拾い上げ、カバースリップの端と背面に軽く触れて、カバースリップから水分を軽くたたきます。
待機中のマウントメディアの液滴にカバースリップをそっと下げます。顕微鏡とイメージング。接眼レンズを使用して、サンプルに焦点を合わせるようにZレベルを手動で調整します。
ソフトウェア内の取得したタブに切り替えます。スマートセットアップを使用して、イメージングに使用する蛍光チャンネルを選択します。カバースリップの中央に配列し、合計12の位置を画像化します。
カバースリップの中央にRAを配置します。自動化された方法で複数の場所を画像化することができます。シミュレートされたトレーニング データを生成します。
コードをダウンロードし、内容を解凍します。指示と readme に従って環境をセットアップします。という名前のフォルダに移動します src「コピーを作成するか、フォルダ2を使用します。
ミトコンドリアシミュレーションエアリー」と改名。このフォルダーには、トレーニング データのシミュレーションに関連するすべてのファイルが含まれています。シミュレーションに設定するパラメータは 3 セットあります。
まず、バッチ設定ファイルで、シミュレータのミトコンドリア数、直径範囲、Z軸範囲、蛍光色素密度のパラメータを設定します。次に、データセットの開口数、倍率、最小波長の光学パラメータをファイル顕微鏡で設定し、PSFモード。py"ファイアgenerate_batch_parallelの画素サイズと発光波長に希望の値を設定します。
py"出力画像のサイズ、各画像のタイル数、ファイルgenerate_batch_parallel内の合計画像数など、出力データセットに関する3番目のパラメーターセットを設定します。py"ファイルgenerate_batch_parallelを実行します。py"をクリックしてシミュレーションを開始します。
最終的なサイズのイメージを取得するには、5 という名前のフォルダーのコピーを作成します。データ準備とトレーニング/データ準備」に移動し、そこに移動します。バッチ数とバッチあたりの画像数、ファイルData_generatorに追加するノイズの範囲のパラメータを設定します。
py"ファイルData_generatorを実行します。py"モンタージュ画像を作成します。image"とセグメント"という名前のフォルダをデータトレイン/トレーニング"フォルダにコピーします。
ディープラーニングベースのセグメンテーション。新しい顕微鏡画像設定のセグメンテーションモデルをトレーニングするには、train"という名前のフォルダーに移動し、train_unetという名前のファイル内で、バッハサイズ、セグメンテーションのバックボーンモデル、エポック数、およびトレーニングの学習率のパラメーターを設定します。py"ファイルtrain_unetを実行します。
py"トレーニングを開始します。トレーニングプロセスでは、シミュレートされた検証セットのセグメンテーションモデルを評価するためのメトリックが表示されます。トレーニングが完了すると、モデルはbest_modelとして保存されます。
h5 "という名前のフォルダで train「顕微鏡画像でモデルをテストするには、画像を列車モデルが望むサイズに分割する必要があります。このためには、6という名前のフォルダに移動します。テストデータを準備します」とデータのPNG形式のファイルをフォルダPNGにコピーします」そしてファイルsplit_1024_256を実行します。
py"これにより、データフォルダ内の画像の256 x 256サイズのトリミングが作成されます。画像の切り抜きをセグメント化するには、7という名前のフォルダーに移動します。セグメンテーションをテストし、segmentという名前のファイルを実行します。
py"を使用する保存済みモデルの名前を設定した後。セグメント化された画像は出力フォルダーに保存されます。形態素解析。
make_montageという名前のファイルを配置します。py"を7という名前のフォルダに入れます。セグメンテーションをテストし、ファイルを実行して、セグメント化された出力を画像の元のサイズに戻します。
9 という名前の新しいフォルダーを作成します。形態素解析」をソースフォルダに移動し、そのフォルダに移動します。コマンドを使用してskanライブラリとseabornライブラリをインストールしますpip seaborn skanをインストール「セグメンテーションマスクは、skanという名前のライブラリを使用してスケルトン化されます」個々のミトコンドリアのトポロジーを分析できるようにします。
ファイルをフォルダー 9 に配置します。形態素解析「実験の異なるグループの画像をフォルダ7内の異なるフォルダに配置する。テストセグメンテーション「ファイルを実行して、分析用のプロットを作成します。業績。
実行する定量分析は、研究の質問または仮説によって異なります。実験では、ミトコンドリアの3つの異なる形態、すなわちドット「小さなミトコンドリアビット」、ロッド「ミトコンドリアのような繊維状または糸状、およびマルチブランチネットワーク」に興味を持ち、形態を特定するために、まずセグメンテーション出力をスケルトン化し、異なるクラスの分岐リンクを分析しました。ガラクトース適合細胞の2群、対照群とCCCP処理群についての解析結果を示す。
CCCPにさらされたときにミトコンドリアが受ける腫れを考えると、ドットの平均分岐長の大幅な増加が見られます。細胞がCCCPで処理された場合、桿体とネットワーククラスの両方の個々の長さにおけるミトコンドリアの割合は、対照と比較して有意に減少し、したがって私たちの仮説を検証します。私たちの方法にとって挑戦的なシナリオは、画像が密集したミトコンドリアを持っている場合です。
ピンク色は、画像で検出された最長の単一ミトコンドリアを示しており、これはセグメンテーション結果の誤差の増加が原因です。これらの失敗例は、ミトコンドリアの長さの制御と形態学的演算子を使用して検出できます。私たちのアプリケーションは、ミトコンドリアの形態の解析方法の一例ですが、そのような解析とそれに関する研究の質問は、マイトファジーおよび関連する生物学的実験のさまざまな側面に対して定式化できると考えています。
