Demonstramos o uso de uma ferramenta de aprendizado de máquina supervisionada por simulação para analisar mitocôndrias em imagens de microscopia fluorescente de células fixas. Os métodos atuais para segmentar mitocôndrias em imagens de microscopia incluem métodos baseados em limiares automáticos, como Ostu ou segmentação manual. As técnicas baseadas em limiares têm um desempenho ruim quando a relação sinal/plano de fundo é baixa.
Normalmente, as imagens para a análise morfológica apresentam um grande número de mitocôndrias, tornando a segmentação manual tediosa. Os métodos supervisionados de aprendizado profundo realizam segmentação com alta precisão, mas exigem um grande número de dados de entrada do par terra-verdade para treinamento. Essa abordagem usa um simulador baseado em física para gerar pares de imagens de microscopia e sua máscara de forma de verdade do solo 2D, eliminando assim a necessidade de anotação manual.
O modelo treinado em imagens simuladas é então usado para segmentar mitocôndrias em imagens de microscópio reais. Usamos uma ferramenta de segmentação baseada em aprendizado profundo que permite a automação dessa tarefa com alta precisão e que não requer um conjunto de dados anotado de verdade fundamental para treinamento. A simulação começa com a geração de geometria usando curvas paramétricas para geração de formas.
Os emissores são uniformemente distribuídos e colocados aleatoriamente na superfície da forma gerada, de modo que a densidade corresponda aos valores experimentais. Um PSF 3D do microscópio é calculado usando o modelo de Gibson-Lanni. Para alcançar o fotorrealismo entre as imagens simuladas e as imagens experimentais, emulamos os ruídos escuros e disparados.
A física ground-truth é gerada na forma de um mapa binário. Avaliamos o efeito do tratamento com CCCP na morfologia mitocondrial de cardiommioblastos fixos fotografados usando um microscópio confocal. Cultura celular.
Prepare-se para semear as células, operando em um exaustor de fluxo laminar estéril, colocando uma folha de cobertura para cada condição experimental em um poço de uma placa de 12 poços. Certifique-se de que a suspensão de células diluídas esteja devidamente misturada, pipetando o conteúdo do tubo de centrífuga para cima e para baixo várias vezes antes de dispensar o volume apropriado para cada poço. Procedimento experimental.
Aspirar meios de cultura celular dos poços da placa de 12 poços e, em seguida, aplicar rapidamente meios pré-aquecidos frescos aos poços de controle e ao meio pré-aquecido com solução de CCCP micromolar 10 para os poços de condição de teste. Incubar na incubadora de células de 37 graus Celsius por duas horas. Aspirar meios de cultura celular dos poços e aplicar a solução de fixação pré-aquecida.
Coloração e montagem de células em folhas de cobertura. Adicione um meio de montagem de 10 microlitros a uma lâmina de vidro preparada para montar uma folha de cobertura. Pegue a folha de cobertura da placa de 12 poços usando pinças e tire a umidade das folhas de tampa tocando brevemente a borda e a parte de trás da tampa deslize para a toalha de papel sem fiapos preparada.
Abaixe suavemente a tampa deslize para baixo na gota de espera do meio de montagem. Microscópio e imagem. Usando os óculos, ajuste manualmente o nível Z para ter a amostra em foco.
Alterne para a guia adquirida dentro do software. Use a configuração inteligente para selecionar o canal de fluorescência a ser usado para geração de imagens. Centrado na matriz no meio da folha de cobertura com 12 posições totais a serem visualizadas.
Posicione a AR centralizada no centro da corrediça da tampa. É possível criar imagens de vários locais de forma automatizada. Geração de dados de treinamento simulados.
Baixe o código e descompacte o conteúdo. Siga as instruções e leia-me para configurar o ambiente. Navegue até a pasta chamada src"Faça uma cópia ou use a pasta 2.
simulação de mitocôndrias arejada "e renomeá-lo. Esta pasta contém todos os arquivos relacionados à simulação dos dados de treinamento. Existem três conjuntos de parâmetros a serem definidos para a simulação.
Primeiro, defina os parâmetros de número de mitocôndrias, faixa de diâmetro, faixa de eixo Z e densidade de fluoróforos para o simulador no arquivo de configuração em lote. Em seguida, defina parâmetros ópticos de abertura numérica, ampliação e comprimento de onda mínimo do conjunto de dados no microscópio de arquivoPSFmode. py"Defina o valor desejado para o tamanho do pixel e o comprimento de onda de emissão no generate_batch_parallel de incêndio.
py"Defina o terceiro conjunto de parâmetros em relação ao conjunto de dados de saída, como o tamanho das imagens de saída, o número de blocos em cada imagem e o número total de imagens no arquivo generate_batch_parallel. py"Execute o arquivo generate_batch_parallel. py"para iniciar a simulação.
Para obter a imagem de tamanho final, faça uma cópia da pasta chamada 5. Preparação de dados e treinamento/preparação de dados" e navegue até ele. Defina os parâmetros do número do lote e o número de imagens por lote, intervalo de ruído a ser adicionado no arquivo Data_generator.
py"Execute o arquivo Data_generator. py"criar as imagens de montagem. Copie as pastas chamadas image"and segment"na pasta datatrain/train".
Segmentação baseada em deep learning. Para treinar o modelo de segmentação para uma nova configuração de imagem de microscópio, navegue até a pasta chamada "e defina os parâmetros de tamanho de bach, modelo de backbone para a segmentação, o número de épocas e a taxa de aprendizado para treinamento dentro do arquivo chamado train_unet. py"Execute o arquivo train_unet.
py"para iniciar o treinamento. O processo de treinamento exibe a métrica para avaliar o modelo de segmentação no conjunto de validação simulado. Após a conclusão do treinamento, o modelo é salvo como best_model.
h5"na pasta denominada trem"Para testar o modelo nas imagens do microscópio, as imagens devem ser divididas para o tamanho desejável pelo modelo de trem. Para isso, navegue até a pasta chamada 6. Prepare os dados de teste"e copie os arquivos de formato PNG dos dados para a pasta PNG"e execute o arquivo split_1024_256.
py"Isso criará 256 por 256 cortes de tamanho das imagens na pasta de dados. Para segmentar cortes de imagem, vá para a pasta chamada 7. Teste a segmentação" e execute o arquivo chamado segmento.
py"depois de definir o nome do modelo salvo a ser usado. As imagens segmentadas são salvas na pasta de saída. Análise morfológica.
Coloque o arquivo chamado make_montage. py"na pasta chamada 7. Teste a segmentação" e execute o arquivo para costurar a saída segmentada de volta ao tamanho original da imagem.
Crie uma nova pasta chamada 9. Análise Morfológica" na pasta de origem e navegue até ela. Instale as bibliotecas skan e seaborn usando o comando pip install seaborn skan"As máscaras de segmentação são esqueletizadas usando a biblioteca chamada skan"para permitir a análise da topologia da mitocôndria individual.
Coloque o arquivo na pasta 9. Análise Morfológica"Organize as imagens de diferentes grupos do experimento em diferentes pastas dentro da pasta 7. Segmentação de teste"Execute o arquivo para criar gráficos para a análise. Resultados.
A análise quantitativa a ser realizada depende das questões ou hipóteses da pesquisa. Em nosso experimento, estávamos interessados nas três morfologias diferentes das mitocôndrias, ou seja, pontos "pequenos bits de mitocôndrias, bastonetes" semelhantes a fibras ou cordas como mitocôndrias e redes multi-ramificadas"Para identificar a morfologia, primeiro esqueletizamos a saída de segmentação e analisamos os elos de ramificação das diferentes classes. Mostramos os resultados da análise para os dois grupos de células adaptadas à galactose, o grupo controle e o grupo tratado com CCCP.
Observamos um aumento significativo nos comprimentos médios dos ramos dos pontos, o que é esperado, dado o inchaço que as mitocôndrias sofrem quando expostas ao CCCP. A porcentagem de mitocôndrias em comprimentos individuais de ambas as classes de bastonetes e redes é significativamente reduzida em relação ao controle quando as células foram tratadas com CCCP, verificando assim nossa hipótese. Um cenário desafiador para o nosso método é quando a imagem tem mitocôndrias densamente compactadas.
A cor rosa indica a mitocôndria única mais longa detectada na imagem, o que é causado devido ao aumento do erro nos resultados da segmentação. Esses casos de falha podem ser detectados por um controle dos comprimentos das mitocôndrias e usando operadores morfológicos. Embora nossa aplicação seja um exemplo de como realizamos análises da morfologia mitocondrial, acreditamos que tal análise e questões de pesquisa em torno dela podem ser formuladas para vários aspectos da mitofagia e experimentos biológicos relacionados.
