Мы демонстрируем использование инструмента машинного обучения под наблюдением моделирования для анализа митохондрий в флуоресцентных микроскопических изображениях фиксированных клеток. Современные методы сегментации митохондрий в микроскопических изображениях включают автоматические методы на основе пороговых значений, такие как Ostu или ручная сегментация. Методы, основанные на пороговых значениях, работают плохо там, где отношение сигнала к фону низкое.
Как правило, изображения для морфологического анализа имеют большое количество митохондрий, что делает ручную сегментацию утомительной. Контролируемые методы глубокого обучения выполняют сегментацию с высокой точностью, но требуют большого количества входных данных пары земля-истина для обучения. Этот подход использует симулятор на основе физики для создания пар микроскопических изображений и их 2D-маски наземной истины, что устраняет необходимость в ручной аннотации.
Модель, обученная на смоделированных изображениях, затем используется для сегментации митохондрий в реальных микроскопических изображениях. Мы используем инструмент сегментации на основе глубокого обучения, который позволяет автоматизировать эту задачу с высокой точностью и не требует аннотированного набора данных наземной правды для обучения. Моделирование начинается с генерации геометрии с использованием параметрических кривых для генерации фигур.
Излучатели равномерно распределены и случайным образом размещены на поверхности генерируемой формы таким образом, чтобы плотность соответствовала экспериментальным значениям. 3D PSF микроскопа вычисляется с использованием модели Гибсона-Ланни. Чтобы достичь фотореализма между смоделированными изображениями и экспериментальными изображениями, мы эмулируем как темные, так и снятые шумы.
Физическая основа-истина генерируется в виде двоичной карты. Мы оцениваем влияние лечения CCCP на морфологию митохондрий фиксированных кардиоммиобластов, визуализированных с помощью конфокального микроскопа. Клеточная культура.
Подготовьтесь к посеву клеток, работающих в стерильной ламинарной вытяжке, поместив крышку для каждого экспериментального состояния в колодец из 12-луночной пластины. Убедитесь, что разбавленная клеточная суспензия правильно перемешана, пипетируя содержимое трубки центрифуги вверх и вниз несколько раз, прежде чем дозировать соответствующий объем в каждую лунку. Экспериментальная процедура.
Аспирировать среду клеточных культур из скважин пластины 12 скважин затем быстро наносить свежую предварительно нагретую среду в контрольные скважины и предварительно нагретую среду с 10 микромолярным раствором CCCP в испытательное состояние скважин. Инкубируйте в клеточном инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Аспирировать культуральную среду клеток из скважин и применять предварительно нагретый фиксирующий раствор.
Окрашивание и крепление ячеек на крышках. Добавьте 10 микролитровых монтажных носителей к подготовленному стеклянному слайду для крепления крышки. Поднимите крышку с 12-луночной пластины с помощью пинцета и смахните влагу со скольжения крышки, ненадолго коснувшись края, а задняя часть крышки скользит к подготовленному бумажному полотенцу без ворса.
Осторожно опустите крышку вниз на ожидающую каплю монтажного носителя. Микроскоп и визуализация. Используя окуляры, вручную отрегулируйте уровень Z, чтобы образец был в фокусе.
Переключитесь на приобретенную вкладку в программном обеспечении. Используйте интеллектуальную настройку для выбора флуоресцентного канала, который будет использоваться для визуализации. Массив с центром в середине крышки с 12 позициями для изображения.
Положение RA центрировано по центру скольжения крышки. Можно автоматически отображать несколько мест. Создание смоделированных обучающих данных.
Загрузите код и распакуйте содержимое. Следуйте инструкциям и файлу readme для настройки среды. Перейдите в папку с именем src"Сделайте копию или используйте папку 2.
симуляция митохондрий воздушная» и переименовать его. Эта папка содержит все файлы, связанные с моделированием обучающих данных. Для моделирования необходимо задать три набора параметров.
Сначала задайте параметры количества митохондрий, диапазона диаметра, диапазона оси Z и плотности флуорофоров для симулятора в пакетном конфигурационном файле. Далее задают оптические параметры числовой апертуры, увеличения и минимальной длины волны набора данных в файловом микроскопеPSFmode. py"Установите требуемое значение для размера пикселя и длины волны излучения в generate_batch_parallel огня.
py"Задайте третий набор параметров для выходного набора данных, таких как размер выходных изображений, количество плиток в каждом изображении и общее количество изображений в файле generate_batch_parallel. py"Запустите файл generate_batch_parallel. py", чтобы начать моделирование.
Чтобы получить изображение окончательного размера, создайте копию папки с именем 5. Подготовка данных и обучение/подготовка данных» и переходите в него. Задайте параметры номера пакета и количество изображений в пакете, диапазон шумов, добавляемых в файл Data_generator.
py"Запустите файл Data_generator. py" создают монтажные изображения. Скопируйте папки с именем image" и segment" в папку datatrain/train".
Сегментация на основе глубокого обучения. Для обучения модели сегментации для новой настройки изображения микроскопа перейдите в папку с именем train" и задайте параметры размера баха, магистральной модели для сегментации, количества эпох и скорости обучения внутри файла с именем train_unet. py"Запустите файл train_unet.
py", чтобы начать обучение. В процессе обучения отображается метрика для оценки модели сегментации в моделируемом наборе проверок. После завершения обучения модель сохраняется как best_model.
h5" в папке с именем train"Чтобы проверить модель на изображениях микроскопа, изображения должны быть разделены до размера, желаемого моделью поезда. Для этого перейдите в папку с именем 6. Подготовьте тестовые данные" и скопируйте файлы данных формата PNG в папку PNG" и запустите файл split_1024_256.
py"Это создаст обрезки изображений размером 256 на 256 в папке данных. Чтобы сегментировать обрезки изображений, перейдите в папку с именем 7. Проверка сегментации" и запустите файл с именем segment.
py" после установки имени сохраненной модели для использования. Сегментированные изображения сохраняются в выходную папку. Морфологический анализ.
Поместите файл с именем make_montage. py" в папку с именем 7. Проверьте сегментацию» и запустите файл, чтобы сшить сегментированные выходные данные обратно к исходному размеру изображения.
Создайте новую папку с именем 9. Морфологический анализ» в исходной папке и перейдите в нее. Установите библиотеки skan и seaborn с помощью команды pip install seaborn skan"Маски сегментации скелетируются с помощью библиотеки skan", чтобы можно было анализировать топологию отдельных митохондрий.
Поместите файл в папку 9. Морфологический анализ»Упорядочить изображения разных групп эксперимента в разные папки внутри папки 7. Тестовая сегментация"Запустите файл для создания графиков для анализа. Результаты.
Количественный анализ, который должен быть выполнен, зависит от вопросов исследования или гипотезы. В нашем эксперименте нас интересовали три различные морфологии митохондрий, а именно точечные «маленькие биты митохондрий», палочки, похожие на волокна или струнные митохондрии, и многоветвистые сети» Чтобы идентифицировать морфологию, мы сначала скелетируем выход сегментации и анализируем ветвистые звенья различных классов. Показаны результаты анализа для двух групп клеток, адаптированных к галактозам, контрольной группы и группы, получавшей КЦКП.
Мы видим значительное увеличение средней длины ветвей точек, что ожидается, учитывая набухание митохондрий при воздействии CCCP. Процент митохондрий в отдельных длинах как стержней, так и сетевых классов значительно снижается по сравнению с контролем, когда клетки были обработаны CCCP, что подтверждает нашу гипотезу. Сложный сценарий для нашего метода — когда изображение имеет плотно упакованные митохондрии.
Розовый цвет указывает на самую длинную одиночную митохондрию, обнаруженную на изображении, что вызвано повышенной погрешностью в результатах сегментации. Эти случаи сбоя могут быть обнаружены путем контроля длин митохондрий и использования морфологических операторов. Хотя наше приложение является примером того, как мы проводили анализ митохондриальной морфологии, мы считаем, что такой анализ и исследовательские вопросы вокруг него могут быть сформулированы для различных аспектов митофагии и связанных с ней биологических экспериментов.
