该协议允许在病毒感染期间以某些形态变化的形式连续检测瞬时效应，例如贴壁细胞的分离和漂浮。该协议允许采用非侵入性和非劳动密集型方法，用于连续监测细胞形态变化并捕获终点测定可能遗漏的瞬时效应，如血管渗漏。如果细胞是贴壁细胞，则该方案可用于分析不同实验设置中其他细胞系的血管完整性变化。
准备好 HUVEC 后，双击桌面上的图标启动 RTCA 软件应用程序。在登录窗口中输入用户名和密码。将 A1 孔朝内的 96 孔 RTCA 电阻板放入位于细胞培养箱中的 RTCA 站中。
然后转到 RTCA 软件的实验说明选项卡并键入实验名称、设备序列号和设备类型。在RTCA软件单元选项卡下的布局选项卡中，突出显示所有孔，然后右键单击突出显示的孔以确保所有孔都已打开。接下来，打开 RTCA 软件的时间表选项卡。
单击“Step_1”，然后将扫描设置为 10 秒，将间隔设置为 30 秒。然后单击软件左上角的“开始”继续“以开始验证运行。运行后，打开单元格索引选项卡以检查数据。
所有单元格索引值都应小于 0.063。然后检查单元格索引选项卡下部的原始扫描数据，以查找手稿中描述的重复值模式。要完成验证运行，请单击板，然后选择释放板。
从 RTCA 站拆下 96 孔 RTCA 电阻板。为了获得RTCA的背景读数，用每孔60微升HBSS洗涤胶原蛋白1型涂层的专用金微电极板两次。弃去剩余的HBSS，每孔细胞外基质加入50毫升。
然后将板放入位于细胞培养箱中的RTCA站中，A1孔朝内。在 RTCA 软件的 exp notes 选项卡中，键入实验名称、设备序列号和设备类型。导航到 RTCA 软件的单元格选项卡，然后选择布局选项卡。
突出显示要使用的孔，然后右键单击突出显示的孔以确保所有孔都已打开。现在转到RTCA软件的时间表选项卡。单击“Step_1”，然后单击左上角的“开始”或“继续”以获取背景读数。
该板现在已准备好进行细胞接种并从RTCA站取出。之后，用每孔 50 微升的调节培养基将每孔 HUVEC 的 10 至第 4 个细胞接种在金微电极板中。将板放回位于细胞培养箱中的RTCA站中，A1孔朝内。
然后在软件的时间表选项卡中，单击左上角的添加步骤。点击Step_2。将扫描更改为 601，间隔更改为两分钟，然后单击应用。
单击“Step_2”，然后单击软件左上角的“开始”或“继续”。孵育 20 小时后，当孔图选项卡中的细胞指数值显示平台期时，板已准备好感染。在 RTCA 软件的计划选项卡中，单击中止步骤。
该板现在已准备好从RTCA站中移除。要感染 HUVEC，请从零下 80 摄氏度的冰箱中取出寨卡病毒库存。在1.5毫升离心管中用无血清细胞外基质稀释寨卡病毒原液，以实现0.1和1的多重感染。
接下来，丢弃每个孔中的调节培养基，并在使用孔的侧面时用 60 微升 HBSS 冲洗每个孔。将 40 μL 稀释的病毒样品加入孔中，从最高到最低稀释度，使用孔的一侧。将板在37摄氏度的细胞培养箱中用5%二氧化碳孵育，以吸收病毒。
每 15 分钟旋转板 5 次，以使病毒在整个细胞单层中吸收。孵育一小时后，从最低浓度到最高浓度取出并丢弃病毒悬浮液。用 60 毫升 HBSS 洗涤受感染的细胞两次。
用补充有 2%FBS 的细胞外基质覆盖孔。对于阳性对照孔，用补充有 2% FBS 的细胞外基质稀释凝血酶 20 单位/毫升，并使用孔的一侧用含有凝血酶的细胞外基质培养基覆盖孔。现在单击“计划”选项卡，然后在左上角添加一个步骤。
导航到 Step_3，并将扫描修改为 3， 601，并将间隔修改为 2 分钟。单击应用，然后在弹出的窗口中单击“确定”。将受感染的专用金微电极板（A1孔朝内）放入位于培养箱中的RTCA站中。
最后，单击Step_3，然后单击软件左上角的开始继续。与阴性感染对照组相比，感染寨卡病毒P6-740的HUVECs的细胞指数值在感染后15小时开始下降，多重感染为0.1。感染较高剂量寨卡病毒 P6-740 的 HUVEC 在感染后 11 小时多次感染时显示细胞指数下降。
感染后24小时，当内皮细胞感染时，归一化细胞指数值分别下降5%和7%，感染的多重性分别为0.1和1。感染后 96 小时和感染后 66.75 小时，感染后 66.75 小时的归一化细胞指数值分别降低 50%，感染倍数分别为 0.1 和 1。归一化细胞指数值在感染后107 h达到最低点，感染后分别降低51%和60%，多重感染分别为0.1和1。
发现归一化细胞指数值从感染后 107 小时到感染后 168 小时实验结束分别增加了 4% 和 13%。在每次RTCA实验之前，使用96孔RTCA板进行电阻器验证对于确保每个生物传感器都能正常工作以产生可靠的细胞指数值至关重要。
