سمح هذا البروتوكول بالكشف المستمر عن التأثير العابر في شكل بعض التغيرات المورفولوجية أثناء العدوى الفيروسية ، مثل انفصال وتعويم الخلايا الملتصقة. سمح هذا البروتوكول باتباع نهج غير جراحي وغير كثيف العمالة للمراقبة المستمرة للتغيرات المورفولوجية الخلوية والتقاط التأثير العابر مثل تسرب الأوعية الدموية الذي يمكن تفويته بواسطة فحص نقطة النهاية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحليل التغيرات في سلامة الأوعية الدموية لخطوط الخلايا الأخرى في إعدادات تجريبية مختلفة إذا كانت الخلايا خلايا ملتصقة.
بعد إعداد HUVECs ، قم بتشغيل تطبيق برنامج RTCA بالنقر المزدوج فوق الرمز الموجود على سطح المكتب. اكتب اسم المستخدم وكلمة المرور في نافذة تسجيل الدخول. ضع صفيحة مقاومة RTCA 96 بئرا مع توجيه البئر A1 للداخل في محطة RTCA الموجودة في حاضنة زراعة الخلايا.
ثم انتقل إلى علامة تبويب ملاحظات التجربة في برنامج RTCA واكتب اسم التجربة والرقم التسلسلي للجهاز ونوع الجهاز. في علامة تبويب التخطيط ضمن علامة تبويب الخلية في برنامج RTCA ، قم بتمييز جميع الآبار ، وانقر بزر الماوس الأيمن على الآبار المميزة لضمان تشغيل جميع الآبار. بعد ذلك ، افتح علامة تبويب الجدول الزمني لبرنامج RTCA.
انقر فوق Step_1 ، واضبط عمليات المسح على 10 وفاصل زمني على 30 ثانية. ثم انقر فوق ابدأ متابعة في الزاوية العلوية اليسرى من البرنامج لبدء تشغيل التحقق. بعد التشغيل ، افتح علامة تبويب فهرس الخلية للتحقق من البيانات.
يجب أن تكون جميع قيم فهرس الخلية أقل من 0.063. ثم تحقق من بيانات المسح الأولي في الجزء السفلي من علامة تبويب فهرس الخلية بحثا عن أنماط القيمة المتكررة كما هو موضح في المخطوطة. لإنهاء تشغيل التحقق ، انقر فوق اللوحة ، وحدد لوحة التحرير.
قم بإزالة لوحة مقاومة RTCA للبئر 96 من محطة RTCA. للحصول على قراءة خلفية عن RTCA ، اغسل لوحة الأقطاب الكهربائية الدقيقة المتخصصة من الكولاجين من النوع الأول مرتين باستخدام 60 ميكرولتر لكل بئر من HBSS. تجاهل HBSS المتبقية ، وإضافة 50 ملليلتر لكل بئر من المصفوفة خارج الخلية.
ثم ضع اللوحة في محطة RTCA الموجودة في حاضنة زراعة الخلايا مع توجيه البئر A1 إلى الداخل. في علامة تبويب ملاحظات exp في برنامج RTCA، اكتب اسم التجربة والرقم التسلسلي للجهاز ونوع الجهاز. انتقل إلى علامة تبويب الخلية في برنامج RTCA وحدد علامة تبويب التخطيط.
قم بتمييز الآبار المراد استخدامها ، وانقر بزر الماوس الأيمن على الآبار المميزة للتأكد من تشغيل جميع الآبار. انتقل الآن إلى علامة تبويب الجدول الزمني لبرنامج RTCA. انقر فوق Step_1 ، وانقر فوق ابدأ أو متابعة في الزاوية العلوية اليسرى للحصول على قراءة الخلفية.
اللوحة جاهزة الآن لبذر الخلايا وإزالتها من محطة RTCA. بعد ذلك ، قم بزرع 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر من HUVECs في لوحة القطب الدقيق الذهبي مع 50 ميكرولتر لكل بئر من الوسط المكيف. ضع اللوحة مرة أخرى في محطة RTCA الموجودة في حاضنة زراعة الخلايا ، بحيث يكون البئر A1 مواجها للداخل.
ثم في علامة التبويب "الجدول الزمني" الخاصة بالبرنامج ، انقر فوق إضافة خطوة في الزاوية اليسرى العليا. انقر فوق Step_2. قم بتغيير عمليات المسح إلى 601 ، والفاصل الزمني إلى دقيقتين ، وانقر فوق تطبيق.
انقر فوق Step_2 ، وانقر فوق ابدأ أو استمر في الزاوية العلوية اليسرى من البرنامج. بعد 20 ساعة من الحضانة عندما تظهر قيم مؤشر الخلية في علامة تبويب الرسم البياني للبئر هضبة ، تكون اللوحة جاهزة للعدوى. في علامة التبويب جدولة برنامج RTCA، انقر فوق إحباط الخطوة.
اللوحة جاهزة الآن للإزالة من محطة RTCA. لإصابة مركبات HUVEC ، استرجع مخزون فيروس زيكا من المجمد الذي تبلغ درجة حرارته 80 درجة مئوية تحت الصفر. تمييع مخزون فيروس زيكا مع مصفوفة خارج الخلية خالية من المصل في أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر لتحقيق مضاعفات العدوى من 0.1 وواحد.
بعد ذلك ، تخلص من الوسط المكيف من كل بئر ، واشطف كل بئر ب 60 ميكرولترا من HBSS أثناء استخدام جانب البئر. أضف 40 ميكرولترا من عينة الفيروس المخففة إلى البئر ، بدءا من التخفيف الأعلى إلى الأدنى ، باستخدام جانب البئر. احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح بامتصاص الفيروس.
قم بتدوير اللوحة خمس مرات كل 15 دقيقة للسماح بامتصاص الفيروس في جميع أنحاء الطبقة الأحادية للخلية. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، قم بإزالة معلق الفيروس والتخلص منه من أدنى تركيز إلى أعلى. اغسل الخلايا المصابة مرتين ب 60 ملليلتر من HBSS.
تراكب الآبار بمصفوفة خارج الخلية مكملة ب 2٪ FBS. بالنسبة لآبار التحكم الإيجابية ، قم بتخفيف الثرومبين في 20 وحدة لكل مليلتر مع مصفوفة خارج الخلية مكملة ب 2٪ FBS ، وقم بتراكب الآبار مع الثرومبين الذي يحتوي على وسط مصفوفة خارج الخلية ، باستخدام جانب البئر. انقر الآن على علامة التبويب الجدول الزمني ، وأضف خطوة في الزاوية اليسرى العليا.
انتقل إلى Step_3، وقم بتعديل عمليات المسح إلى 3،601، والفاصل الزمني إلى دقيقتين. انقر فوق تطبيق ، ثم انقر فوق "موافق" في النافذة المنبثقة. ضع لوحة الأقطاب الكهربائية الدقيقة المتخصصة من الذهب المصابة بحيث يكون البئر A1 مواجها للداخل في محطة RTCA الموجودة في حاضنة الاستزراع.
أخيرا ، انقر فوق Step_3 ، وانقر فوق ابدأ متابعة في الزاوية اليسرى العليا من البرنامج. بدأت قيمة مؤشر الخلية لمركبات HUVEC المصابة بفيروس زيكا P6-740 عند تعدد العدوى 0.1 في الانخفاض بعد 15 ساعة من الإصابة ، مقارنة بالسيطرة السلبية على العدوى. أظهرت HUVECs المصابة بجرعة أعلى من فيروس زيكا P6-740 عند تعدد العدوى بواحد انخفاضا في مؤشر الخلية بعد 11 ساعة من الإصابة.
في 24 ساعة بعد الإصابة ، كان هناك انخفاض بنسبة 5٪ و 7٪ في قيمة مؤشر الخلية الطبيعية عندما أصيبت الخلايا البطانية بتعدد العدوى 0.1 وواحد على التوالي. تم تسجيل انخفاض بنسبة 50٪ في قيمة مؤشر الخلية الطبيعية في 96 ساعة بعد الإصابة و 66.75 ساعة بعد الإصابة عند الإصابة بتعدد العدوى 0.1 وواحد على التوالي. وصلت قيمة مؤشر الخلية الطبيعية إلى أدنى نقطة لها في 107 ساعة بعد الإصابة ، مع انخفاض بنسبة 51٪ و 60٪ عند الإصابة عند تعدد العدوى 0.1 وواحد على التوالي.
تم العثور على قيمة مؤشر الخلية الطبيعية لزيادة 4٪ و 13٪ من 107 ساعة بعد الإصابة فصاعدا حتى نهاية التجربة في 168 ساعة بعد الإصابة. قبل كل تجربة RTCA ، يعد تشغيل التحقق من المقاوم باستخدام لوحة RTCA 96 جيدا أمرا ضروريا لضمان عمل كل مستشعر حيوي بشكل جيد لإنتاج قيم مؤشر خلية موثوقة.
